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申请/专利权人：南开大学

摘要：本发明公开了一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法，该方法首先通过马弗炉热解制备小麦秸秆生物炭，接着加入氢氧化钠溶液做碱改性，并置于管式炉中800℃热解，得到氢氧化钠改性生物炭，保存备用。接着将碱改性生物炭与氯化铁和氯化亚铁水合物在乙醇溶液中充分混合，混合物在管式炉中500℃热解制得磁性多孔生物炭SBC@Fe3O4，将其分散在戊二醛溶液中，得到SBC@Fe3O4@GA的磁改性戊二醛激活生物炭。最后通过三因素五水平正交实验法在上述载体中根据不同酶炭比，加入不同浓度梯度的漆酶溶液，用磁力搅拌器搅拌数小时，得到SBC@Fe3O4@GA@Lac产物，并根据漆酶的负载量选取最佳固定化方法。本发明具有成本低，适合大规模制备，酶流失少等优点。

主权项：1.一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1小麦秸秆生物炭的制备：取天然小麦秸秆粉末，在烘箱中烘干，随后于马弗炉中热解，得到小麦秸秆生物炭WBC；其中，烘箱温度为105℃，保温时间为220min；马弗炉加热温度为500℃，加热时间为2.5h；2碱改性生物炭制备：将步骤1获得的生物炭WBC与NaOH溶液按质量比1比3充分混合，在室温下用磁力搅拌器搅拌两小时，随后置于烘箱中烘干，将干燥样品放置在刚玉舟中，并以氮气作为环境气氛，在管式炉中热解，并冷却至室温，将制备好的生物炭用1.5molL的盐酸浸泡两小时，接着用去离子水洗涤数次，在烘箱中烘干，用100目筛子使其均匀化制得碱改性生物炭SBC，存于玻璃干燥皿内，备用；其中，氢氧化钠溶液浓度为4molL；烘箱温度为105～120℃；管式炉氮气流量为80～100mlmin，加热速率为10℃min加热温度至500℃，再以加热速率为5℃min加热温度至800℃，保温时间为90min；3磁改性生物炭制备：将步骤2中获得的碱改性生物炭与0.02molFeCl3·6H2O和0.01molFeCl2·4H2O在乙醇溶液中充分混合，将混合物置于刚玉舟中，用锡纸遮盖于管式炉中热解，并冷却至室温，随后用去离子水洗涤数次，制得磁性多孔生物炭SBC@Fe3O4；其中，管式炉氮气流量为80～100mlmin，加热温度为500℃，加热速率为10℃min，保温时间为110min；4固定化漆酶制备：将步骤3中获得的磁改性生物炭分散在戊二醛溶液中，随后，活化的载体用去离子水和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，在烘箱中烘干得到SBC@Fe3O4@GA的磁改性戊二醛激活生物炭，接着按照炭酶比1:2，漆酶浓度2UmL，固定化时间16h进行固定化漆酶制备，得到SBC@Fe3O4@GA@Lac产物，并根据漆酶的负载量的多少选取最佳固定化方法，产物用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，抽滤伴以磁铁收集，保存，备用；其中，烘箱温度为105℃；柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH为5，由0.1molL柠檬酸溶液与0.2molL磷酸氢二钠溶液混合而成；戊二醛溶液体积比为2.5％；所述步骤4中漆酶负载量的测定方法如下：称取0.05g固定化产物，加入1mL缓冲液，在温度为4℃、离心力为8000g条件离心10min，取上清液即为待测液，在石英比色皿中分别加入500微升蒸馏水和500微升考马斯亮蓝指示剂作为空白，随后在石英比色皿中分别加入500微升待测液和500微升考马斯亮蓝指示剂在620nm下测得吸光度，通过计算得到漆酶的负载量mgg；公式如下：初始漆酶的蛋白浓度CimgmL＝0.07×ΔA+0.0007；固定化后漆酶的蛋白浓度CfmgmL＝0.07×ΔA+0.0007；其中，ΔA代表测定前后吸光度的变化， 其中，V1代表初始漆酶蛋白浓度测定过程中添加的游离漆酶溶液量mL，V2代表固定化后漆酶蛋白浓度测定过程中添加的待测液量mL。

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