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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明涉及一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法，属于农业生物技术领域。斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置获得玉米茎尖转化受体；将玉米茎尖转化受体在农杆菌液OD600为0.65，真空渗透压为0.050MPa，真空处理时间为3min，乙酰丁香酮最终浓度为150μM的条件下进行侵染，培养3周，经除草剂Basta初筛获得抗性苗或者经PCR检测证明外源基因已转入玉米基因组DNA中。经PCR检测T1代转化植株，证明外源基因可遗传至后代。本发明首次针对玉米建立简化的不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系，对玉米遗传转化技术具有重要意义，可以有效推进玉米分子育种进程。

主权项：1.一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，其特征在于，斜切玉米胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，获得玉米茎尖转化受体；步骤包括：1玉米茎尖转化受体的准备取成熟的玉米种子，浸泡后避光萌芽，待玉米胚芽长至0.8-1.5cm时，斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，切面肉眼看到白色倒三角形，即为获得的玉米茎尖转化受体；2带有目的基因的植物双元表达载体的农杆菌转化带有目的基因的植物双元表达载体转化农杆菌感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取质粒并进行PCR检测，经验证后含有载体的农杆菌菌液则可用于下一步，添加终浓度20％体积比的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；取出存放在-80℃保存的农杆菌菌液，置于冰中融解，在无菌超净台中，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，在无菌超净台中，用接种环挑取活化的农杆菌菌株，均匀地划线于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基平板中，培养条件为28℃和48h；3农杆菌重悬液的制备取生长的转化的农杆菌的YEP固体培养基平板，倒入蒸馏水，重悬菌体至烧杯中，获得农杆菌重悬液；4真空渗透法转入目的基因将玉米茎尖转化受体放在农杆菌重悬液中，在真空条件下进行农杆菌侵染，侵染后覆土进行常规培养；5转基因植株的获得3周后，待玉米植株长至3-4叶期，取新叶，CTAB法提取DNA进行PCR鉴定，鉴定完成后，移栽，待T0转化植株结种；取T0代转化植株种子，种于基质中，出苗后取T1代转化玉米植株叶片，提取DNA进行PCR鉴定；所述农杆菌为LBA4404；所述农杆菌菌液浓度OD600为0.65，真空渗透压为0.050MPa、真空处理时间为3min、乙酰丁香酮浓度为150μM时为农杆菌遗传转化最佳条件。

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