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申请/专利权人：俄亥俄大学

摘要：本发明提供稳定的单体性磷铂，即，含有顺‑环己二胺配位体或对映体富集或对映纯的反‑环己二胺配位体的焦磷酸合铂II或铂IV络合物，以及这些络合物的合成。针对多种癌症确定了磷铂化合物的效力和毒性，包括敏感和抗药性的卵巢癌、头颈癌和结肠癌。公开了包含铂络合物的组合物以及借助于所述络合物或包含所述络合物的组合物治疗增生性疾病或病症的方法。

主权项：1.一种磷铂络合物，选自由以下组成的组：i具有式I的对映纯1R,2R-焦dach-2： 或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

全文数据：磷铂及其在治疗癌症中的用途[0001]本申请是申请日为2011年6月2日、国际申请号为PCTUS2011038948、国家申请号为201180038716.5、发明名称为“磷铂及其在治疗癌症中的用途”的发明专利申请的分案申请。[0002]相关申请的交叉参考[0003]本申请根据35U.S.C.§119e款要求2010年6月4日提交的申请号为61351,514的美国临时专利申请的优先权，该申请的全文通过引用并入本文。技术领域[0004]本申请一般地涉及焦磷酸钼络合物（pyrophosphatoplatinumcomplexes;所提供的络合物的合成方法;包含所提供的络合物的组合物；以及使用所提供的络合物、包含所提供的络合物的组合物或其组合治疗增生性疾proliferativedisease的方法。背景技术[0005]在2008年，全球有超过1200万人被诊断出患有癌症，并且有超过700万人死于癌症。事实上，癌症是发达国家中主要的死亡原因，并且是发展中国家中死亡的第二大主要原因（仅次于HIVAIDS。一旦患者被诊断出患有癌症，其预后prognosis在很大程度上取决于诸如以下因素，如是否癌症在早期被诊断出，癌症是否已经扩散到全身，以及癌症是否或已经对已知的化疗方案产生耐药性becomeresistantto。[0006]基于铂的抗癌药物顺铂、卡铂和奥沙利铂被广泛地用于治疗各种癌症，如卵巢癌、睾丸癌、小细胞肺癌和结肠直肠癌。这些化合物可以与包括放射治疗在内的其它治疗方案联合（incombinationwith使用，以治疗广泛系列（expandedarray的癌症。目前来说，利用铂化合物的辅助治疗模式中有超过600种临床试验强调underscore铂化合物可有效治疗多种其它癌症的潜力。例如，最近的研究结果突破性表明，将糖尿病药物罗格列酮与卡铂联合使用可有效地治疗多种形式的癌症。现在，本申请已经对不断增长的铂platinum-based抗癌药物的应用增加了新的层面newdimension，因为大多数的辅助治疗已主要局限于癌症药物或放射药物与其它癌症药物的联合用药上。因此，仍然需要不断发展新的铂基抗癌药物以及铂基抗癌药物的新应用。[0007]诸如顺铂的常规铂化疗药物主要通过转录抑制和通过复制抑制过程transcriptioninhibitionandthroughreplicationinhibitionprocesses在细胞周期（cellcycle的G2期引发细胞凋亡（initiateapoptosis，特别是在高剂量情况下。以链内和链间两种模式通过鸟嘌呤和腺嘌呤碱基的N7位点与DNA共价结合被认为是触发导致细胞凋亡程序性细胞死亡）的细胞反应级联cascadeofcellularresponse的关键性分子事件。在了解顺钼的细胞和分子金属合-生物化学metallo-biochemistry的复杂性及细胞毒性的分子机制后，许多挑战性问题已被确定。简言之，人们已经注意到，铂化DNAplatinatedDNA是引发细胞毒性的关键。高迀移率蛋白（HMG将铂结合的DNAplatinum-bound与由核苷酸切除修复NER酶进行的修复隔离。此外，据信这些铂-DNA加合物激活P53转录因子以诱导组蛋白磷酸化并触发染色质凝聚。[0008]虽然基于铂的化疗药物被广泛用于治疗癌症，但它们在大量患者中的应用是有限的，因为存在着严重的副作用，如肾毒性、神经毒性、耳毒性、骨髓抑制和对铂-金属药物的获得性抗药性。例如，有显著百分比的患者变成对顺铂治疗具有抗药性。虽然卡铂与顺铂相比降低了一些毒性，但其并没有减轻抗药性。目前来说，奥沙利铂被批准用于治疗结肠直肠癌，但其抗药性在很大程度上是未知的。[0009]本领域中缺乏对常规铂基化疗药物的分子水平的抗药性发展的了解并且缺乏克服这种抗药性的方式的了解。虽然这些了解尚不完全，但据信通过主要由从DNA中切除结合钼boundplatinum的方式以修复DNA损伤的能力促成了抗药性机制。牵涉到促成抗药性的其它机制包括：由与铜转运蛋白CTRl的表达下调有关的吸收降低所致的减少的顺铂细胞内积累；由cM0AT、ATP7A和ATP7B的过度表达所致的增加的流出（efflux;削弱的促凋亡基因下调和抗凋亡基因上调。另一方面，CTRl蛋白质的上调与增加的耳毒性有关。还已经假设MAPK的交替和由谷胱甘肽及其它小分子和蛋白质特别是金属硫蛋白）导致的铂去活是导致对铂药物的抗药性的作用因素。鉴于上述情况，人们需要有克服对铂药物的抗药性的方法，包括开发不易受DNA修复机制影响的药物。[0010]在各种实施方案中，专利号为7,700,649Bose的美国专利和专利申请号为12722,189Bose的美国专利申请通过公开了涉及新一类铂络合物的合成路线及癌症治疗方法而满足了本领域中的一些需求，这类铂络合物即是具有铂（II或铂（IV金属中心metalcenters的焦磷酸合络合物。所公开的化合物及其方法为药物开发策略的一部分，所述药物开发策略是基于生成一类不共价结合DNA的铂抗肿瘤剂，从而使得基于DNA修复的抗药性无效nullify。这一策略是对常规铂药物开发方法的模式转变，而在常规的铂药物开发方法中，DNA结合是开发更有效的铂抗癌剂的核心主题。[0011]在专利号为7，700,649®ose的美国专利和专利申请号为12722，189Bose的美国专利申请中公开的焦磷酸合铂络合物当中有外消旋反-±-1，2_环己二胺焦磷酸合铂（II和外消旋反-±-1，2_环己二胺-反-二羟基焦磷酸合铂（IV。虽然已经发现这些外消旋络合物对于治疗某些癌症是有效的，但仍然需要改进的药物开发方法，包括但不限于提高焦磷酸合铂治疗剂的有效性、降低这种治疗剂的毒性和通过改进参与杀灭癌细胞的基因的靶向来抑制癌细胞的生长。发明内容[0012]在各实施方案中，本申请通过公开了基于对映纯（enantiopure和富对映体enantioenriched的单体性焦磷酸钼络合物的药物开发策略而满足前述的需求。因此，本发明提供焦磷酸合铂络合物的最有效形式并且披露了识别参与杀灭癌细胞和抑制癌细胞生长的靶基因。所提供的络合物是稳定的，与常规的抗癌剂相比显示出增强的细胞毒性和更高的有效性。这一药物开发策略也是对常规的铂药物开发方法的模式转变，而在常规的铂药物开发方法中，DNA结合仍然是核心主题。[0013]在各种实施方案当中，本申请提供分离的单体性（顺或反-1,2-环己二胺）（二氢焦磷酸合铂（II和（顺或反-1，2-环己二胺-反-二羟基合二氢焦磷酸合铂（IV络合物，其中所述络合物是对映纯的，或者包含对映体过量enantiomericexcess的基于顺-I，2_环己二胺的络合物或两种可区别的基于反-I，2_环己二胺的络合物中的一种。因此，本发明提供选自以下的铂（II和铂（IV络合物：（i1R，2R-1，2-环己二胺）（二氢焦磷酸合铂（II本文中称为“1R，2R_焦dach-2”）；（ii1S，2S-1，2-环己二膨（二氢焦磷酸合铂（11本文中称为“（13,25-焦1^-2”）；出111?，25-1，2-环己二膨（二氢焦磷酸合）铂（II或（1S，2R-1，2-环己二胺）（二氢焦磷酸合）铂（II它们是可重叠的镜像化合物，并且本文中统称为“顺-焦dach-2”）；（iv1R，2R-1，2-环己二胺-反-二羟基合二氢焦磷酸合铂（IV本文中称为“1R，2R_焦dach-4”）；（V1S，2S-1，2-环己二胺-反-二羟基合二氢焦磷酸合铂（IV本文中称为“1S，2S_焦dach-4”）；和vi1R，2S-1，2-环己二胺-反-二羟基合二氢焦磷酸合铂（IV或（IS，2R-1，2-环己二胺-反-二羟基合二氢焦磷酸合铂（IV它们是可重叠的镜像化合物，并且本文中统称为“顺-焦dach-4”）；以及（i-vi中任一种的药学上可接受的盐或溶剂化物。参考1，2-环己二胺配位体上的氨基基团，在化合物（i、（ii、（iv和V中，（1R，2R和（1S，2S立体化学代表呈反式构型的氨基基团，而在化合物（iii和vi中，（1R，2S和（1S，2R立体化学代表呈顺式构型的氨基基团。[0014]另外，本发明在一些实施方案中提供包含治疗有效量的一种或多种所提供的络合物和至少一种药学上可接受的成分如载体、稀释剂、辅助剂或载体的组合物。[0015]本发明还在其它实施方案中提供通过对需要治疗的受试者施用治疗有效量的包含一种或多种所提供的络合物的组合物来治疗一种或多种增生性疾病的方法。附图说明[0016]虽然说明书以权利要求结尾，特别指出并清楚地要求了本发明请求保护的范围，但相信从以下的描述中结合附图可以更好地理解本发明，其中：[0017]图1显示立体异构体⑴（1R，2R_焦dach-2、（II1S，2S_焦dach-2、（III顺-焦dach-2、（IV1R，2R_焦dach-4、（V1S，2S_焦dach-4、（VI顺-焦dach-4和反_±_焦dach-2的圆二色谱；[0018]图2描述由通过将人卵巢癌细胞A2780暴露于各种浓度的化合物24小时所进行的克隆生成试验（clonogenicassays所测定的（1R，2R-焦dach-2、（1S，2S-焦dach-2和反-±-焦dach-2的活性；[0019]图3描述由通过将顺钼抗药性的人卵巢癌细胞0VCAR-10暴露于各种浓度的化合物24小时所进行的克隆生成试验所测定的（1R，2R-焦dach-2、（1S，2S-焦dach-2和反-±-焦dach-2的活性；[0020]图4是在根据本文公开的实施方案对小鼠中的人卵巢癌细胞施用磷铂的六周期间当中的平均肿瘤尺寸图；[0021]图5显示下文详述的（IR,2R-焦dach-2和（IR,2R-焦dach-4针对顺铂抗药性人卵巢癌细胞0VCAR-10的效力；[0022]图6显示随时间推移的肿瘤尺寸图，比较了每隔一天施用一次达三天（“q〇dx3”）的对照PBSBic、按60mgkg给药qodx3施用）的卡钼和按40mgkg给药[每天一次施用，连续三天（“qdx3”）]的（1R，2R-焦dach-4的情况;且[0023]图7显示下文详述的（IR,2R-焦dach-2[qodx3施用和连续四天每天一次施用“qdx4”）]和（IR,2R-焦dach-4qdx4施用针对人头颈癌UMSCClOb的效力。具体实施方式[0024]现在描述本发明的具体实施方案。然而，本发明可具有不同的实施方式，并且不应当被解释为仅限于本文中给出的实施方案。相反，所提供的这些实施方案在于使本发明的公开内容详尽完整，并且对本领域技术人员充分地表达本发明的范围。[0025]除另有定义外，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。本发明的说明书中的术语使用仅是为了描述特定的实施方案，并非旨在限制本发明。如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种”、“一个”（a，an及“所述”（the也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地指示不同的情况。[0026]要指出的是，像“优选地”、“通常”和“典型地”之类的术语在本文中不是用来限制请求保护的发明范围，也不意味着某些特征对于请求保护的本发明的结构或功能来说是关键性的、必要的或者甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出替代性的或附加的特征，这些特征可用在或不用在本发明的特定实施方案中。[0027]术语“基本上”在本文中用来表示固有的不确定度，这种不确定度可归因于任何定量比较、数值、测量或其它表述。术语“基本上”在本文中还用来表示定量表述可能会偏离规定基准而不导致所关注的主题物质的基本功能改变的程度。如此，其在涉及元件或特征的布置时用来表示可归因于任何定量比较、数值、测量或其它表述的固有不确定度，所述元件或特征虽然在理论上可预期显示出精确的对应关系或行为，但实际上的具体实施可能略小于精确值。[0028]除另指出外，所有在说明书和权利要求书中使用的如分子量、反应条件等表示成分、性质的量的数字均应被理解为在所有的情况下由术语“约”修饰，该术语旨在表示所示值的最多±10%。此外，说明书和权利要求书中任何范围的公开应被理解为包括该范围本身并且也包括归入其中的任何范围以及端点。除另指出外，说明书和权利要求书中给出的数值属性为近似值，其可能会根据要在本发明的实施方案中获得的所需属性情况而有所不同。尽管给出本发明的宽范围的数值范围和参数为近似值，但具体实施例中给出的数值则是尽可能精确地记录的。然而，任何数值都固有地含有一定的误差，这种误差是由于在各自的测量中存在的误差而必然产生的。[0029]如本文中所用，术语“磷铂”通常是指与单个双齿焦磷酸合配位体（bidentatepyrophosphatoligand配合的钼络合物。根据本文描述的实施方案的磷钼可具有如下的一般结构A和⑶：[0030][0031]其中L1和L2表示中性配位体独立地选自NH3;取代或未取代的脂族胺;和取代或未取代的芳族胺或单个双齿中性配位体选自取代或未取代的脂族或芳族二胺），端基L1和L2配合于铂金属中心;L3和L4为配合于铂金属中心的配位体选自氢氧化物、乙酸、丁酸和α-羟基酸、胺或其带电物）。焦磷酸合配位体可以是中性的（未示出）或带电的（如所示）。当带电时，焦磷酸合配位体与由Z+表示的反离子共存。Z+的例子包括但不限于氢;碱金属，如钠和钾;及单价的有机部分。优选地，Z+是得到药学上可接受的盐的反离子。无论是带电的还是中性的，由（A表示的铂（II络合物的一般结构为方形平面的，而由⑶表示的铂（IV络合物的一般结构为八面体的。[0032]一般来说，磷铂不易经历水解，在中性pH值下可溶于水溶液，并且在中性pH值的水溶液中是稳定的。此外，磷铂在癌细胞系中显示出细胞毒性，并且在对顺铂和卡铂中的一者或两者为抗药性的细胞系中是有效的。因此，磷铂在诱导癌细胞死亡方面是有效的，并且在某些情况下与已知的铂抗癌药物相比是更有效的，并且在适合对患者施用的溶液中表现出可取的稳定性和溶解度。如本文中涉及本发明的磷铂所用，“稳定的”是指当将络合物保持在6-8pH值范围内的水溶液中时，其抗水解性达2到六天之间的一段时间。[0033]与顺铂、卡铂及相关的基于铂的抗癌剂不同，磷铂不共价结合DNA。据信对顺铂、卡钼及相关的基于钼的抗癌剂的抗药性是源于由包括核切除修复酶（nuclearexcisionrepairenzymes在内的多种酶对DNA损伤的有效修复。然而，因为磷钼不共价结合DNA，所以对磷铂的抗药性不可能是由于DNA修复机制。数据表明磷铂引发fas及fas相关转录因子、一些促凋亡基因（如Bak和Bax和肿瘤抑制基因（如PUMA和PTEN的过度表达。此外，磷铂下调抗凋亡基因BCL2。处理由这些基因转录的蛋白质表达的蛋白质印迹WesternBlot实验显示了平行趋势。此外，磷铂的细胞结合低于顺铂，但磷铂仍表现出高的细胞毒性。因此，本发明提供具有不同于本领域中的分子靶向的有效的铂抗癌剂。[0034]术语“对映体过量”是根据其通常所理解的定义用在本文中的。也就是说，对于两种对映体A和B，所述两种对映体可分别以摩尔量Ma和Mb存在于混合物中，在混合物中以较高摩尔量存在的对映体的对映体过量E可表示为关系IMa-MbΛΜα+ΜβX100I，其中E0%。对映体A和B的“外消旋混合物”可由诸如“rac”和或“（±”的缩写标示或者简单地没有任何关于对映体的提示具有E=0%，因为Ma=Mb。作为进一步的说明，由A和B组成且其中Ma=60%且Mb=40%的混合物的A对映体过量等于20%。在替代方式中，相同的混合物可被视为是由80%的A和B的外消旋混合物与20%的对映纯A组合构成的混合物，因为每个分子B混合物的40%可与混合物中的分子A混合物的40%配对，剩下未配对的过量的分子A混合物的20%。[0035]如本文中所用，关于具有两种对映体A和B的分子的术语“对映纯”是指基本上只含有对映体A或B之一而不是含有A和B两者的化合物或组合物。对于“对映纯”络合物，97%SE彡100%〇[0036]如本文中所用，术语“富对映体的”在其最广泛的意义上是指这样的化合物或组合物，其含有具有两种对映体A和B的分子，使得该化合物或组合物具有对映体过量的一种对映体，无论是A还是B。因此，“A和B的富对映体混合物”可指A对映体过量的混合物或指B对映体过量的混合物，其中无论对于A还是B，0%30μΜ相比，（1R，2R_焦dach-2显示出9.7μΜ的IC5Q值。[0140]在反式异构体当中，克隆生成试验表明（1R，2R_焦dach-2和（1R，2R_焦dach-4异构体的活性分别远优于外消旋混合物反-±-焦dach-2和反-±-焦dach-4。例如，当使反-±-焦dach-4暴露于人卵巢癌细胞A2780达一小时时，发现IC5q值为180±15μΜ;而对于（1R，2R_焦dach-4在其它方面相同的实验条件表1下，发现相同细胞系的IC5q为40±10PMt3IRJR-异构体长时间暴露于多种人癌细胞系产生低得多的IC5q值，表明这些化合物具有作为有效抗癌药物的潜力。例如，由克隆生成试验，（IR，2R_焦dach-2对人卵巢细胞的IC50值为500ηΜ0.5μΜ，对抗药性的人头颈癌为2μΜ。[0141]当暴露Α2780细胞至少24小时时，对映纯（1R，2R_焦dach-2和（1S，2S_焦dach-2化合物两者在实验误差范围内显示出相等的活性。但当暴露细胞的时间段较短（例如1小时）时，观察到（1R，2R-与（1S，2S_形式之间的活性差。在较短时间暴露的情况下，与（1S，2S-异构体相比，（1R，2R-形式显示出优异的活性，表明（IR,2R-异构体由细胞吸收较快。与（IR,2R-或者（1S，2S-形式相比，对于外消旋形式的较高IC5q值可表明两种形式的自缔合self-association，这可能由细胞以降低的速率吸收。[0142]对于新denovo的对顺铂具有抗药性的人卵巢癌0VCAR-10，（IR，2R-焦dach-2显示出比（1S，2S-焦dach-2更好的体外疗效。值得注意的是，在人卵巢癌细胞系0VCAR-10表2和5和0VCAR-8表5中，（1R，2R-焦dach-2显示出显著优于顺铂的活性。[0143]与其它化合物相比，顺式异构体显示出针对人卵巢癌A2780的优异活性。例如，在暴露于A2780细胞24小时后，顺-焦dach-2和顺-焦dach-4显示出IC5Q值分别为300nM和4μΜ，相比之下相应的（1R，2R_焦dach-2或（1R，2R_焦dach-4形式分别为Ι.ΟμΜ和18μΜ。要注意的是，在相同的条件下，顺铂和卡铂产生高得多的IC5q值，即分别为5.ΟμΜ和60μΜ。[0144]不旨在受理论的约束或限制，预期的化学原理的教导是，外消旋形式的IC5q值应等于（1R，2R-异构体和（1S，2S-异构体的各自IC5q值的算术平均值。然而，如上表中所示，基于（1R，2R-对映体和（1S，2S-对映体的5050混合物，外消旋形式（例如，A2780中的焦dach-2的IC5q值远高于预期。这些数据表明，由于不明确的原因，基于对映体的分布，外消旋形式的效力低于预期。一种似乎合理的解释可能是，外消旋形式自缔合，并因此不能由细胞有效地吸收。[0145]在进一步的测试中，将细胞用铂化合物连续处理7天。固定集落并用4%甲醛中的2%结晶紫染色。记下含有超过50个细胞的集落。将来自三个同样平板的所记集落的数目进行平均，并将此数除以接种细胞数以得到形成集落的细胞分数fraction值。然后校正形成集落的细胞的这些分数值，方式是用所述分数除以在没有用铂化合物处理的平板中形成集落的细胞数目，获得接种效率。用A2780的集落形成数据示于图2。注意（1R，2R_焦dach-2和（IS，2S-焦dach-2对映体两者产生几乎相同的IC5q值，（IR，2R为1.0±0.ΙμΜ，且（IS，2S为1.1±0.ΙμΜ，而外消旋混合物产生高得多的IC5Q值，为2.4±0.2μΜ，表示外消旋混合物效力较低。0VCAR-10的类似数据示于图3,比较了（IR,2R-焦dach-2RD2、（IR,2R-焦dach-4RD4、反-±-焦dach-2T-D2和反-±-焦dach-4T-D4。[0146]临床研究已表明，奥沙利铂的（1R，2R_对映体，参考与存在于本文中所述的磷铂相同的奥沙利铂中的1，2_二氨基环己烷载体配位体，显示出优于奥沙利铂的其它立体异构体的效力。与奥沙利铂相反，焦dach-2和焦dach-4两者的所有三种焦磷酸合异构体（即，11?，21?-、（15,25-和顺式针对多种癌症都是非常具有活性的。然而似乎没有普遍性的趋势。例如，如上面详述的那样，（IR,2R-焦dach-2和（IS，2S-焦dach-2在人A2780癌细胞中显示出几乎相等的IC5q值，这是当将这些化合物暴露于细胞24小时的情况下得到的，而对于新的对顺铂具有抗药性的人卵巢癌0VCAR10，（1R，2R_焦dach-2显示出更好的体外疗效。另一方面，在所有的人卵巢癌细胞中，（IS，2S-焦dach-4显示出优于（IR，2R-焦dach-4的活性。与反式异构体相比，焦dach-2和焦dach-4的顺式异构体显示出针对人卵巢癌A2780的优异活性。因此，所述数据整体表明，与外消旋形式相比，用特定的异构体以较低的剂量，通过避免来自外消旋形式中存在的其它异构体的毒性，由此可以治疗一些特定的癌症。[0147]实施例9[0148]通过免疫荧光监测Fas过度表达[0149]在2·5mL培养基中用得自Dr·ThomasHamiltonFoxChaseCancerCenter，宾夕法尼亚州费城）的人卵巢癌细胞A2780和A2780C30对30μΜ顺铂和ΙΟΟμΜ卡铂具有交叉抗药性接种在具有松弛的经预处理的盖玻片的六孔板中。在连续用5%C02供气的37°C温育箱中使用补充以10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.25个单位mL的胰岛素和青霉素链霉素（100个单位mLFisherScientific，宾夕法尼亚州匹兹堡）的RPMI1640将细胞培养为单层。[0150]用来自上述合成实施例的磷铂化合物之一对70%融合度的细胞处理1小时。然后将板用冰冷的磷酸盐缓冲盐水PBS小心地洗涤两次，更换成常规的培养基，并在37°C下用5%W2再温育丨小时。用PBS洗涤盖玻片两次，并用新鲜制备的i%甲醛处理细胞，然后在室温下温育5至7分钟。将固定的细胞用I3BS洗涤三次，并在4°C下用2%FBSPBS封闭30分钟，随后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤5分钟。[0151]在室温下取下单独的盖玻片并翻转到在ParafiIm''表面上的IOOyL的FAS—级抗体（CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA在5%BSA1%乳PBS中的1:100稀释液之上达1小时。随即将盖玻片转回至洁净的六孔板用于各次后续的洗涤，即用PBS洗涤三次，每次5分钟。将盖玻片再次翻转到另一洁净的parafi|m®表面上，并在室温下用IOOyL在5%BSA1%乳PBS中以1:500稀释的二级FITC-抗体温育1小时。然后用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。然后将湿润的盖玻片安装到具有Ultraeruz®安装培养基与DAPI4’，6_二脒基-2-苯基卩引噪）的显微镜载片之上（SantaCruzBiotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯），用于鉴定细胞核。使用荧光显微镜以10X、40X和100X的放大率进行显微镜检查。[0152]实施例10[0Ί53]用于蛋白质表达的蛋白质印迹免疫染色（Immunodecoration[0154]按12%SDS-PAGE电泳，在4°C用100V经1.5小时将蛋白质转移至PVDF膜。将膜用0.05%TWEEN-20和Tris-缓冲盐水TBST溶液洗涤，并用5%无脂干乳和I%BSA封闭。在4°C下将膜用所关注蛋白质的一级抗体的1:25，000稀释液温育过夜。用0.05%TBST洗涤膜，接着在相应的HRP-偶联抗体（I:40,000稀释）中温育。使用ECL-Advance化学发光系统Amersham-GEHealthcareBiosciences,宾夕法尼亚州匹兹堡）显现蛋白质。[0155]磷铂激活许多促凋亡和肿瘤抑制基因，如FAS、PTEN、PUMA、BAX等。蛋白质印迹实验证实了由这些基因转录的高蛋白质表达水平。例如，经反-±-焦dach-4暴露1小时至12小时，用反-±-焦dach-4处理的小鼠显示出FAS高达25倍）、BAX高达4倍）、PUMA高达5倍）的上调和VEGFR的下调（高达50%。同样，BCL2由RR-焦dach-2和RR-焦dach-4下调多达70%。此外，FAS、FADD和铂化合物共同定位于脂筏中。这些激活也与增加的鞘磷脂酶Smase表达有关，如增加的SMase的蛋白质表达所证实。[0156]Smase将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酰胆碱。在典型的实验中，以不同的时间间隔从5分钟到2小时）使癌细胞（IXIO6暴露于（IR,2R-焦dach-2或（IR,2R-焦dach-410μΜ。将细胞离心，收集细胞裂解物并用冷的PBS洗涤。使用Amplexred试剂盒（Invitrogen监测Smase活性。基于包括在试剂盒中的推荐方案进行试验。通常情况下，将IlyL细胞裂解物悬浮在96孔板上的50mM柠檬酸钠缓冲液pH值5.0中，并向每个孔中加鞘磷脂5.OmM。在37°C下将样本温育1小时。温育之后向每个孔中加入含有IOOmMTris-HClΙΟΟμΜ、AmplexRed2个单位mL辣根过氧化物酶、0.2个单位mL胆碱氧化酶和8个单位mL碱性磷酸酶的IOOyLAmplexRed反应溶液（pH值8.0。然后在37°C下将样本温育30分钟。使用530nm至560nm的激发波长测量590nm处的荧光强度。从每个样本测量值中减去来自含有对照样本未处理的孔的荧光值。[0157]实施例11[0158]测定脂筏中的铂[0159]在石墨炉原子吸收光谱仪PerkinElmerAA-600上由通过使用0.1%ΗΝ〇3中的钼标准物PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆）建立的校正曲线定量测定钼含量。将经处理的磷铂细胞用ImL冰冷的I3BS和halt蛋白酶抑制剂PIPierce，伊利诺州罗克福德洗涤4次，并在各次洗涤之间通过在4°：以1000\8离心收集团状物。将细胞团在25^1^1^5?1中培养，并通过采用微BCA方法Pierce，伊利诺州罗克福德）测量蛋白质含量。使用以不同浓度制备的牛血清白蛋白（BSA绘制标准曲线。将定量的蛋白质样本在浓HNO3中消化4小时，接着在分析之前用30%H2〇2处理1小时。[0160]实施例12[0161]SCID小鼠中的毒性研究[0162]在开始进行毒性试验前使4至5周龄的雌性SCID小鼠（c.b-17LCR-PrkdcSCIDCrl,StrainCode236r，CharlesRiverLabs，Wilmington,MA适应一周。通过无菌的26号针头和注射器对小鼠腹膜内（ip注射IOOyL在无菌过滤的PBS中的上述合成实施例中描述的磷钼化合物之一。注射剂量范围在5mgkg至60mgkg，并且是在第1天进行一次、在第3天进行一次和在第5天进行一次。[0163]为评价磷铂化合物的毒性，每天记录不良事件（S卩，体重减轻20%和或摄食量变化、偏离正常行为、其它健康问题或死亡）。将在用磷铂化合物注射的小鼠中发生不良事件的频度和严重程度与小鼠对照组中的进行比较。给予对照组的是模拟注射作为应激反应的对照或由PBS媒介物组成的注射物。[0164]对两组小鼠用市售的铂化合物处理用于比较，与磷铂化合物相比，其剂量基于先前公布的数据（即，顺钼为12mgkg，卡钼为60mgkg。在研究结束时，用358mgkg阿佛丁使所有的小鼠麻醉，并使用26号针头和结核菌素注射器，通过心脏穿刺收集血液。由此，通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10%福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。[0165]以最多40mgkg的不同剂量用反-±-焦dach-2和反-±-焦dach-4对罹患卵巢肿瘤的SCID小鼠进行治疗，并且对肿瘤生长进行长达六周的监测，或者直到肿瘤尺寸变得如此之大而将这些动物处死。然后将用磷铂治疗的小鼠的肿瘤生长或消退与用顺铂治疗的小鼠（7mgkg和用卡钼治疗的小鼠（60mgkg进行比较。当肿瘤长到至少IOOmm3大小的尺寸时，隔日地施用三种剂量的铂化合物。然后利用下式计算总对数细胞杀灭和净对数细胞杀灭：[0166]总对数细胞杀灭=T-C八3.32Td[0167]净对数细胞杀灭=T-C-治疗持续时间3.32Td[0168]其中T和C是以天计的使肿瘤生长到指定尺寸的中值时间，且Td是以天计的使对照动物中的肿瘤尺寸加倍的中值时间。[0169]发现对三剂量治疗方案记录的总对数细胞杀灭值大于3,且剂量为40mgkg时的对数净细胞杀灭值大于2。相反，用顺铂7mgkg治疗的小鼠虽然显示出肿瘤消退，但在7天内死亡。与反-±-焦dach-4相比，用卡铂治疗的小鼠（60mgkg剂量显示低得多的对数细胞杀灭值小于2。进一步增加卡铂剂量是不可能的，因为在60mgkg剂量下群体超过50%已死亡。基于体外数据，据信顺-焦dach-2、顺-焦dach-4、（IR，2R-焦dach-2且特别是（IR，2R-焦dach-4将显示出比外消旋反-±-焦dach-4更好的效力。[0170]实施例13[0171]对卵巢癌细胞系A2780的体内疗效[0172]在细胞培养物中生长稳定的克隆卵巢癌细胞系A2780,直至达到80-90%融合。使用胰蛋白酶GIBC0BRL，GrandIsland，NY分离粘附的细胞。用PBS磷酸盐缓冲盐水彻底洗涤胰蛋白酶化细胞以除去胰蛋白酶。使用人卵巢癌A2780,通过SCIDHairlessOutBred，SHO-PrkdcscldHrhr,CharlesRiverLabs,Wilmington,MA小鼠中的皮下异种移植评价磷铂化合物的效力。在开始进行疗效试验前使4至5周龄的雌性SCID小鼠适应一周。[0173]将癌细胞再悬浮于PBS中，并且除了阴性对照小鼠外，使用无菌26号针头和注射器，将所有的小鼠皮下注射PBS中的IXIO6个细胞0.IOmL至5XIO6个细胞0.10mL，并评价肿瘤随时间的变化。每天检查小鼠的肿瘤生长。使用数显卡尺测量肿瘤。由式W2XL2计算肿瘤体积，其中W是在最宽点的肿瘤测量值，且L是在最长点的肿瘤尺寸，其中以mm3表示的肿瘤的体积相当于以mg表示的重量。[0174]皮下注射癌细胞大约2周后，肿瘤已达到可辨别的肿瘤尺寸大约100-200mm3，开始进行磷铂化合物施用或对照注射。在第1天对小鼠腹膜内施用一次磷铂化合物，在第3天再施用一次，并在第5天再施用一次。用磷铂化合物处理每组异种移植小鼠，并且用媒介物安慰剂PBS溶液和模拟注射作为应激反应的对照处理匹配组。此外，两组小鼠用市售的铂化合物处理，用于与磷铂化合物进行比较，市售铂化合物的剂量基于先前公布的数据即，顺钼为12mgkg，卡钼为60mgkg。[0175]通过测量体重减轻增加和摄食量而每天监测异种移植SCID小鼠健康的任何不良事件。当肿瘤尺寸超过3000mm3时停止测量并结束研究。在研究结束时，用358mgkg阿佛丁麻醉小鼠，并使用26号针头和结核菌素注射器通过心脏穿刺收集血液。由此，通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10%福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。[0176]IR，2R_焦dach-2和（IR，2R_焦dach-4在小鼠异种移植模型（免疫功能低下的NIHIII小鼠）中针对人卵巢癌A2780的疗效数据汇总于图4。在试验中，每隔一天对小鼠进行治疗达三天（“q〇dx3”）一在第1天一次，在第3天一次，且在第5天一次。特别地，用40mgkg的（IR，2R-焦dach-2、10mgkg的（IR，2R-焦dach-4或5mgkg的顺铂处理小鼠。图4的图例中的数字N记录的是试验数，其上显示的数据点是作为平均值得出的。图4中的数据从头十天用（1R，2R-焦dach-2和（1R，2R-焦dach-4治疗清楚地显示出在治疗初始阶段期间的肿瘤消退。[0177]实施例14[0178]对人卵巢癌和人头颈癌的体内疗效[0179]已知人卵巢癌0VCAR-10表现出对顺铂和卡铂两者具有抗药性。分别在细胞培养物中生长稳定的人克隆卵巢癌细胞系0VCAR-10和头颈癌UMSCClOb，直至达到80-90%融合。使用胰蛋白酶GIBCOBRL，GrandIsland，NY以分离粘附的细胞。用PBS磷酸盐缓冲盐水）彻底洗涤胰蛋白酶化细胞以除去胰蛋白酶。通过在3：10此化16%〇1^8^1，5!1〇-PrkdcscidHrhr,CharlesRiverLabs,Wilmington,MA小鼠、NIHNIHIII:NIHBNX-F;NIHS-LystbgFoxnlnuBtkxid,4周龄雌性，TaconicRensselaer，NY小鼠中皮下植入人OVCAR-10和UMSCC-IOb异种移植物评价磷铂化合物的效力。[0180]在开始进行疗效试验前使4-5周龄的雌性SCIDNIH小鼠适应一周。将癌细胞再悬浮于PBS中，并且除了阴性对照小鼠夕卜，将所有的小鼠皮下注射PBS中的IXIO6个细胞0.IOmL至5XIO6个细胞O.lOmL。评价肿瘤尺寸随时间的变化。每天检查小鼠的肿瘤生长。使用数显卡尺测量肿瘤。由式W2XL2计算肿瘤体积，其中W是在最宽点的肿瘤测量值，且L是在最长点的肿瘤尺寸，其中以mm3表示的肿瘤的体积相当于以mg表示的重量。[0181]皮下注射癌细胞大约2周后，肿瘤已达到可辨别的肿瘤尺寸（大约IOOmm3至200mm3，腹膜内施用所需剂量的磷铂化合物。这些施用在第1天进行一次，在第3天进行一次，并在第5天进行一次。[0182]用磷铂化合物处理每组异种移植小鼠，并且用媒介物安慰剂PBS溶液和模拟注射作为应激反应的对照处理匹配组。此外，两组小鼠用市售的铂化合物处理，用于与磷铂化合物进行比较，市售铂化合物的剂量基于先前公布的数据（即，顺铂为12mgkg，卡铂为60mgkg。通过测量体重减轻增加和摄食量而每天监测异种移植SCID小鼠NIH健康的任何不良事件。当肿瘤尺寸超过3000mm3时停止测量并结束研究。[0183]在研究结束时，用358mgkg阿佛丁麻醉小鼠，并使用26号针头和结核菌素注射器通过心脏穿刺收集血液。通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10%福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。[0184]与I3BS碳酸氢盐对照相比，（1R，2R-焦dach-2和（1R，2R-焦dach-4针对人卵巢癌细胞0VCAR-10的疗效数据汇总于图5。当肿瘤达到100-200mm3的尺寸时施用40mgkg体重）剂量。处理的小鼠在治疗时间期间显示出肿瘤消退。对于q〇dx3施用的对照（PBS碳酸氢盐）、以60mgkg进行qodx3施用的卡钼和以40mgkg进行qdx3施用的（1R，2R-焦dach-4,月中瘤尺寸随时间推移的测量值汇总于图6。虚线箭头突出平均肿瘤尺寸达到IOOOmm3的时间以天表示，必要时内插）。与对照相比，尽管卡铂显示出只有约125%的增加寿命的百分比%ILS，但（IR，2R-焦dach-4显示出％ILS为约209%。[0185]1R，2R-焦dach-2和（1R，2R-焦dach-4针对人头颈癌UMSCClOb的疗效数据汇总于图7。剂量是qodx3和或qdx4施用的，范围从10mgkg体重至40mgkg体重。将这些效力与外消旋形式反-±-焦dach-4进行比较。当肿瘤达到100-200mm3的尺寸时施用剂量。[0186]实施例15[0187]IR，2R-焦dach-2和（IR,2R-焦dach-4的最大耐受剂量[0188]为确定最大耐受剂量，对（1R，2R-焦dach-2、（1R，2R-焦dach-4、反-±-焦dach-4、反-±-焦dach-4、顺铂和卡铂进行毒性实验。在4-5周龄雌性ICRCD-I小鼠，TaconicRensselaer，NY中施用从10mgkg至100mgkg逐步增加的剂量。小鼠体重在15g与24g之间。按三剂量治疗方案每隔一天对小鼠注射磷铂之一。总体重减轻20%或更多、外观不旺、体重不增、其它可观察到的健康问题、偏离正常行为或死亡被认为是不良事件。[0189]在10mgkg的较低剂量下，未观察到体重减轻。对于所有的磷铂化合物，在高达40mgkg的最高剂量下未观察到死亡或体重减轻超过20%。可将这些结果与顺铂的情况进行比较，此时在12mgkg的剂量下100%的小鼠死亡，并与卡铂的情况进行比较，此时在60mgkg的剂量下观察到33%死亡。在100mgkg的较高剂量下，在施用十五天之内，所有的小鼠要么体重减轻超过20%，要么死亡。[0190]实施例16[0191]来自实时PCR实验的定量基因表达[0192]进行定量实时PCR实验以评价一些靶向基因的表达。在有或没有顺铂、（1R，2R_焦dach-4和反-±-焦dach-4的RPMI1640中培养人上皮卵巢癌细胞A2780和对顺铂具有抗药性的细胞A2780C30达0、3、12和24小时。在37°C下用5%⑶2将经处理和未经处理的癌细胞两者保持在含10%胎牛血清、2μηιο1L-谷氨酰胺、100个单位mL青霉素-链霉素和0.25个单位mL胰岛素溶液的RPMI1640培养基中。从经处理和未经处理的细胞两者中分离RNA。经处理的细胞是在将细胞按从三小时至24小时的不同时间间隔以磷铂的IC5q值浓度暴露后收获的细胞。[0193]用不含脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶（QIAGENSciences处理RNA样本以除去DNA。然后根据制造商的说明使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒AppliedBiosystems合成cDNA。通过UV光谱法（NanoDrop2000ThermoScientific，Wilmington,DE确定RNA的数量和纯度。采用最小吸光度比例系数在260nm测得的吸光度与在280nm测得的吸光度之比）为1.9作为可接受的纯度。[0194]将分离的RNA样本保存在_80°C，并使之经历最小冻融循环以保持RNA完整性。在相同的反应孔中对靶基因和内源对照肌动蛋白）采用Taqman®基因表达测定进行双工实时PCR。内源对照是用于对祀mRNA进行标准化的参考。最初采用不同的cDNA浓度进行这些链反应以确定检测关注基因所需的最佳cDNA浓度。用蓝染料FAM，吸收:494nm，发射:518nm标记靶基因，而将参考基因用绿染料VIC，吸收：538nm，发射:554nm标记。选择cDNA浓度，使得对于靶基因的阈值循环Ct值在17和32之间，对通过用于测量的ABIStepOnePlus™仪器的荧光检测最敏感。[0195]确定阈值循环数Ct，在该点qPCR反应的荧光刚好超过检测系统的阈值荧光。这些Ct值用于比较靶基因和内源对照的水平。按根据以下关系式由ACt和△ACt值计算的倍数变化（2_AAGt记录定量基因表达：ΛCt=C切E-Ct参考）和ΔΔCt=ΔCt时间X-ΔCt咖》。对照样本未经处理）的倍数表达仍然等于1，因为ΔΔCt的值=0,且因此2°=1〇[0196]本申请不应被认为局限于本文描述的具体实施例和实施方案，而是应该被理解为涵盖本发明的所有方面。可应用于本发明的各种修改、等效过程以及诸多的结构和装置对本领域技术人员来说是显而易见的。本领域技术人员可理解的是，可以做出各种改动而不偏离本发明的范围，且本发明的范围不能被认为局限于说明书中的描述。

权利要求：1.一种磷铂络合物，选自以下构成的组：⑴式⑴的对映纯（IR，2R-焦dach-2，或其药学上可接受的盐或溶剂化物；ii式II的对映纯（1S，2S-焦dach-2，或其药学上可接受的盐或溶剂化物；iv式IV的对映纯（1R，2R-焦dach-4，或其药学上可接受的盐或溶剂化物;和V式V的对映纯（IS，2S-焦dach-4，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。2.—种磷铂络合物，选自以下构成的组：⑴具有对映体过量的式⑴的（IR，2R_焦dach-2或式（II的（1S，2S_焦dach-2的对映体富集的焦dach-2:或其药学上可接受的盐或溶剂化物;和ii具有对映体过量的式IV的（IR，2R-焦dach-4或式V的IS，2S-焦dach-4的对映体富集的焦dach-4:或其药学上可接受的盐或溶剂化物。3.根据权利要求2所述的磷铂络合物，由具有对映体过量0.1%至99%的（1R，2R_焦dach-2的对映体富集的焦dach-2组成。4.根据权利要求2所述的磷铂络合物，由具有对映体过量0.1%至99%的（IS，2S_焦dach-2的对映体富集的焦dach-2组成。5.根据权利要求2所述的磷铂络合物，由具有对映体过量0.1%至99%的（1R，2R_焦dach-4的对映体富集的焦dach-4组成。6.根据权利要求2所述的磷铂络合物，由具有对映体过量0.1%至99%的（1S，2S_焦dach-4的对映体富集的焦dach-4组成。7.—种磷铂络合物，包括权利要求1中所述的任一项技术特征或技术特征的任意组合。8.—种磷铂络合物，包括权利要求2-6中所述的任一项技术特征或技术特征的任意组合。

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