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申请/专利权人：江苏华亘泰来生物科技有限公司

摘要：本发明涉及胃部病理检测领域，提供了一种胃蛋白酶原II的时间分辨微球检测试剂盒制备及检测方法。分别制备了微孔板，铕微球标记的PGII单克隆抗体、缓冲液、浓缩洗板液，并利用制备的上述试剂以及96孔的微孔板，利用时间分辨荧光免疫分析仪进行检测分析，检测步骤简单，测试时间短，测试的量程可达0‑100ngml，检测灵敏度比较高，检测范围比较宽，更有利于胃部疾病的筛查和监控。

主权项：1.一种胃蛋白酶原II的时间分辨微球检测试剂盒制备方法，试剂盒包括盒体，盒体内放置有一块微孔板，六瓶已知浓度的PGII标准品、一瓶铕微球标记的PGII单克隆抗体，一瓶缓冲液，以及一瓶浓缩洗板液，所述微孔板为PGII单克隆抗体包被板，其特征在于，其制备方法为：S1:微孔板制备：（1）取一块洁净的96孔酶标板，量取单克隆抗体并以用溶液E1将单克隆抗体稀释至2ugmL，以每孔100ul滴加酶标板的板孔中，在4℃温度下包被12h，将溶液E1甩掉；溶液E1为Na2CO3与NaHCO3的混合溶液；（2）将溶液E2以每孔200ul滴加到96孔酶标板的板孔内，放置于37℃恒温培养箱中封闭1h；溶液E2为BSA、海藻糖、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4以及ProClin300的混合溶液；（3）从恒温培养箱中取出酶标板，将溶液E2甩掉，并将甩干的酶标板放置于37℃恒温鼓风干燥箱0.5h；（4）从干燥箱中取出酶标板恢复到常温后放置于密闭封口袋中封口，添加干燥剂，然后用铝箔袋密封，放置于2-8℃的环境下保存；S2:铕微球标记的PGII单克隆抗体制备：（1）取一个离心管标记为1号，依次加入纯水140-150ul，海藻糖溶液110-120ul，NaOH溶液40-50ul，时间分辨微球90-110ul，混合后将离心管放置于涡旋混匀仪上涡旋混匀；（2）常温状态下的EDC用纯水稀释成1mgmL，取离心管标记为2号，依次加入纯水170份-180ul，NaOH溶液18-22ul，EDC溶液2-3ul，室温放置于涡旋混匀仪上涡旋混匀，将2号离心管中的200ul溶液加入到1号离心管，在37℃温度下垂直混匀反应0.5h；（3）取离心管标记为3号，将PGII标记抗体用纯水溶解至0.125gl，依次加入PGII标记抗体溶液200ul，C溶液100ul，NaOH溶液20ul，在室温下放置于涡旋混匀仪上涡旋混匀，将3号离心管中的320ul溶液加入1号离心管，于37℃垂直混匀反应3.5h；C溶液为BSA、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4以及ProClin300的混合溶液；（4）1号离心管中依次加入Tris溶液50-52ul，甘氨酸溶液50-52ul，pH值调配到7.5的甘氨酸溶液50-52ul，海藻糖溶液75-80ul，Proclin300溶液2ul，放置于涡旋混匀仪上涡旋混匀，于37℃垂直混匀反应0.5h，之后放置于2-8℃保存；S3:缓冲液制备：（1）将0.22-0.25g的KH2PO4，3.6-3.7g的Na2HPO4，0.20-0.3g的KCl，8-9g的NaCl加入容器中，用量筒量取800ml的纯水倒入容器中，使其完全溶解；（2）添加10-11g的BSA至容器中，用磁力搅拌器搅拌20min，使其完全溶解；（3）用移液器准确量取2ml的ProClin300以及1ml的吐温-20加入到容器中，再用pH计调节溶液pH至6.4，最后添加纯水至1000ml，搅拌使其完全混匀，并过0.22μm滤膜抽滤；S4：浓缩洗板液的制备：（1）将5-7g的KH2PO4，90-92g的Na2HPO4，4-6g的KCl，200g的NaCl加入容器中，用量筒量取800ml的纯水倒入容器中，使其完全溶解；（2）使用移液器准确量取50-55ml的ProClin300以及25-28ml的吐温-20，最后添加纯水至1000ml，搅拌使其完全混匀，并过0.22μm滤膜抽滤。

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