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申请/专利权人：杭州玖格生物医药科技有限公司;中翰盛泰生物技术股份有限公司
摘要：本发明公开了一种功能性P2X1膜蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。通过制备具天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白免疫小鼠；应用单克隆抗体制备技术制备获得8个功能性P2X1单克隆抗体，选择2个功能性较好的克隆进行基因测序，获得功能性可变区序列；选择功能最好的克隆，用人源Fc段替换其鼠源Fc段，制备了1个半人源化嵌合基因工程抗体，经功能验证其功能活性与原鼠源抗体相当，说明其可变区Fab2的序列与其功能活性具有特异相关性。功能性P2X1单克隆抗体具有抑制过表达P2X1细胞钙离子内流、抑制因P2X1过度激活致细胞功能异常、恢复被内毒素抑制的中性粒细胞的趋化功能、提高脓毒症小鼠生存率、抑制肿瘤细胞的分裂增殖和抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的作用。
主权项：1.一种功能性P2X1膜蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1制备天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白；2应用小鼠杂交瘤单克隆抗体制备技术制备获得有功能性的P2X1单克隆抗体；其中步骤1的具体操作方法为扩增收集高表达带小鼠IgGFc段纯化标签的人源P2X1蛋白的hP2X1mFc.copGFP293稳转细胞，于Tris盐酸缓冲液中冰浴匀浆破碎，离心，去上清，称取膜碎片沉淀湿重，共收集膜碎片沉淀湿重不低于100克；加入Tris盐酸缓冲液制备成膜悬液，在膜悬液中，按5％WV加入苯乙烯-马来酸共聚物冻干粉，混合均匀；振荡离心，收集上清液并过0.45μm滤膜，过膜后的滤液过ProteinA柱，用PBS缓冲液洗柱之后，用2倍柱体积的EK酶切缓冲液进行柱平衡，最后加入等柱体积的EK酶切缓冲液，用EK酶室温震荡酶切12h；随后通过重力流穿柱，收集流穿液，用10kD的超滤管置换为PBS缓冲液，并浓缩100倍，获得可溶性的由苯乙烯-马来酸环扣的仍在膜脂质双分子层上的具有天然空间结构和活性的人源P2X1蛋白纳米颗粒。
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