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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开了一种尿液中修饰核苷固相萃取方法及其应用。该方法采用石墨烯材料作为固相萃取柱填料，对人体尿液样本中的多种修饰核苷进行萃取和富集，然后使用液相色谱串联质谱进行分析检测。本发明的优点是可以实现尿液等生物样本中N6‑甲基腺苷m6A、N1‑甲基鸟苷m1G、5‑甲基尿苷m5U、5‑甲基胞苷m5C等多种修饰核苷的同时萃取和富集。本发明方法可在分析化学、代谢组学、临床医学以及预防医学领域中应用，具有很好的推广价值。

主权项：1.一种尿液中修饰核苷固相萃取方法在萃取、富集和检测尿液中修饰核苷中的应用，其特征在于，所述修饰核苷分别为：N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、N1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N7-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、2'-O-甲基尿苷、3-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷，其中采用石墨烯材料作为固相萃取柱填料，同时萃取和富集尿液中多种修饰核苷，然后运用液相色谱串联质谱进行检测分析，从而提高检测灵敏度和准确度，具体通过以下步骤实现：1尿液样本在室温下解冻，在4℃下13000rpm转速离心15分钟，取上清液于1.5mL离心管中，加入同位素内标溶液，并加水稀释；具体为取离心后尿液上清液的体积为5μL，加入同位素内标溶液的体积为5μL，加入水稀释后的总体积为300μL；2称取0.1-1mg吸附剂填料于固相萃取柱中，并依次用甲醇、水进行活化、平衡处理；其中吸附剂填料为石墨烯，质量为0.75mg，固相萃取柱体积为1mL，内径5.5mm，用于封住萃取柱两端的固相萃取柱的筛板直径为5.7mm，活化、平衡溶剂分别为甲醇、水，体积均为1mL；3将稀释的尿样加入到固相萃取柱中，用水清洗，真空泵抽干后进行洗脱并收集洗脱液，将洗脱液进行真空离心干燥；其中水清洗所用的体积为1mL，洗脱液为1.5mL含0.1％乙酸的甲醇溶液；4用水复溶后，进行液相色谱串联质谱分析；所使用的色谱柱为Waters公司的C18色谱柱，其中A相是体积百分比为0.1％的乙酸甲醇；B相是体积百分比为0.1％的乙酸水；采用以下梯度进行洗脱：0-3min95％B；3-5min95-85％B；5-6.5min85-75％B；6.5-8.5min75％B；8.5-9min75-65％B；9-9.5min65-5％B；9.5-10.5min5％B；10.5-11min5％-95％B；11-16min95％B；流速为0.25mLmin；进样量为5μL，进样模式为自动进样；柱温25℃；5运用液相色谱串联质谱技术，将不同浓度的混合标准溶液进行分析检测，利用标准品与其对应同位素内标的峰面积比值，得到线性回归方程，对尿液样本进行测定，代入线性方程，从而计算得到样本中分析物的含量，混合标准溶液为N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、N1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N7-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、2'-O-甲基尿苷、3-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷，使用的稳定同位素内标化合物为[D3]N6-甲基腺苷、[D3]N1-甲基腺苷、[13C5]2'-O-甲基腺苷、[D3]N6,2'-O-二甲基腺苷、[13C15N2]2'-O-甲基鸟苷、[13C15N2]N1-甲基鸟苷、[13C15N2]N7-甲基鸟苷、[D6]N2,N2-二甲基鸟苷、[D3]2'-O-甲基尿苷、[13C15N2]3-甲基尿苷、[13C5]5-甲基尿苷、[13C5]5,2'-O-二甲基尿苷、[D3]2'-O-甲基胞苷、[13CD3]5-甲基胞苷和[13C5]N4-乙酰基胞苷；所述步骤5中混合标准品溶液的浓度范围分别为：1-100nMN6-甲基腺苷、500-5000nMN1-甲基腺苷、0.5-50nM2'-O-甲基腺苷、1-50nMN6,2'-O-二甲基腺苷、10-400nM2'-O-甲基鸟苷、100-2000nMN1-甲基鸟苷、50-1000nMN2-甲基鸟苷、1-100nMN7-甲基鸟苷、100-4000nMN2,N2-二甲基鸟苷、10-400nM2'-O-甲基尿苷、10-250nM3-甲基胞苷、1-50nM5-甲基胞苷、1-100nM5,2'-O-二甲基尿苷、25-1000nM2'-O-甲基胞苷、10-500nM3-甲基胞苷、0.5-10nM5-甲基胞苷和50-4000nMN4-乙酰基胞苷，同位素内标化合物添加量分别为：50fmol[D3]N6-甲基腺苷、625fmol[D3]N1-甲基腺苷、25fmol[13C5]2'-O-甲基腺苷、25fmol[D3]N6,2'-O-二甲基腺苷、112.5fmol[13C15N2]2'-O-甲基鸟苷、1.95pmol[13C15N2]N1-甲基鸟苷、250fmol[13C15N2]N7-甲基鸟苷、625fmol[D6]N2,N2-二甲基鸟苷、125fmol[D3]2'-O-甲基尿苷、250fmol[13C15N2]3-甲基胞苷、50fmol[13C5]5-甲基胞苷、500fmol[13C5]5,2'-O-二甲基尿苷、250fmol[D3]2'-O-甲基胞苷、25fmol[13CD3]5-甲基胞苷和625fmol[13C5]N4-乙酰基胞苷。

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