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申请/专利权人：中国计量科学研究院

摘要：本发明公开了一种基于特征性肽段同位素稀释质谱法的胰岛素定量方法，包括以下步骤：特征肽段选择；合成用于胰岛素定量的标记肽段；特征肽段纯度的测定；特征肽段质谱分析离子对的确定；液相分离及质谱条件优化；样本分析前处理；肽标准曲线制备；检出限和定量限测量、回收率和精密度测量；计算胰岛素样品中特征肽段含量，特征肽段含量乘以系数即得胰岛素浓度。本发明方法可用于定量不同来源的胰岛素和胰岛素类似物，包括猪胰岛素、牛胰岛素、人胰岛素及其他具有GFFYTPK特征性肽段的胰岛素类似物。本发明的定量方法无需进行高温水解，安全性较高。

主权项：1.一种基于特征性肽段同位素稀释质谱法的胰岛素定量方法，其特征在于：包括以下步骤：1特征肽段选择：选择特征肽段序列为GFFYTPK，如SEQIDNo:3所示；根据胰岛素氨基酸序列，用Peptidemass软件设计，Trypsin酶切，选择特征肽段GFFYTPK，理论分子量为858.98Da；合成肽分子量为859Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为430Da；2合成用于胰岛素定量的标记肽段：在特征肽段第三个位点苯丙氨酸F位点标记同位素13C915N，标记同位素分子量10Da，同位素标记肽段分子量为869Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为435Da；3特征肽段纯度的测定：将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度；4特征肽段质谱分析离子对的确定：合成特征肽段标准和标记，进行质谱分析特征肽段的母离子和子离子，调节碰撞能量选择信号强的四对离子，其中信号最强的为定量离子对，其余为定性离子对；三重四级杆质谱仪鉴定特征性肽段离子对为430655、430508、430328、430120；同位素标记肽段离子对为435665、435508、435333、435120，其中430655与435665和430120、435120为定量离子对；5液相分离及质谱条件优化：高效液相色谱参数液相色谱仪：Agilent1260液相色谱；色谱柱：AERISTMPEPTIDEXB-C18150×2.1mm，3.6μm；柱温40℃，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，流速0.2mLmin，流动相梯度：0～3min5％，18min65％，21min90％，24min90％，25min5％；质谱分离条件：三重四级杆质谱仪，离子喷射电压5500V；温度350℃；气帘气体为28Lmin，喷雾气38Lmin；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测；6样本分析前处理：酶解、浓缩样品：样本分析前处理的具体步骤为：a.配制样品：配制1mgmL胰岛素样品；b.酶解：加入胰酶，胰酶与样品质量比为1:16，放入37℃恒温烘箱18h，加10％甲酸2μL终止反应；c.加标记：按照标记：样品的摩尔比1:1加入标记，震荡摇匀；d.浓缩样品，在氮吹仪上浓缩洗脱液，温度45℃，待有机溶剂挥发后，用0.1％甲酸溶解，0.22μm滤膜过滤，上机进行液相质谱检测，进样量7μL；7肽标准曲线制备：标准肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位，将其用三级水配制标准肽标记肽比例为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2的曲线；分析标准肽、同位素内标肽峰面积并制作标准曲线，根据标准曲线计算标准肽浓度；检出限及定量限、回收率及精密度：计算标准肽段的检出限、定量限；计算测量值与理论值之比为方法回收率，在一天内连续测量同一样品计算重复性，在不同天数测量同一样品计算批间精密度；8计算胰岛素样品中特征肽段含量，特征肽段含量乘以系数即得胰岛素浓度；其中，所述系数为胰岛素分子量除以特征肽段分子量；根据下述公式计算酶切溶液中特征肽段的含量， 式中：c为样品中GFFYTPK的含量mgg；ms：样品溶液中GFF*YTPK的质量mg；Rs：样品溶液中GFFYTPK与GFF*YTPK的峰面积比；I1：高标溶液GFFYTPK与GFF*YTPK的质量比；I2：低标溶液GFFYTPK与GFF*YTPK的质量比；R1：高标溶液GFFYTPK与GFF*YTPK的峰面积比；R2：低标溶液GFFYTPK与GFF*YTPK的峰面积比M：样品质量mg；P：GFFYTPK的纯度。

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