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申请/专利权人：华南师范大学

摘要：本发明公开了一种基于FRET双杂交分析的活细胞药物筛选方法及系统。一方面在多孔板上使用转染FRET标准质粒的细胞样本进行预实验确定实验条件，包括细胞接种密度、成像物镜、激发光强、视野分析范围及测量FRET系统校准参数。另一方面在预实验的实验条件下进行基于FRET双杂交分析的活细胞药物筛选，先进行细胞培养，设置药物组和对照组并进行FRET三通道成像，计算ED、EA和Rc，并绘制ED‑Rc图和EA‑1Rc图；再使用ED‑Rc与EA‑1Rc线性分离的FRET双杂交分析法得到EDmax、EAmax和NAND并通过饱和指标sRatio进行数据筛选；最后通过显著性差异检验得到药物组中的活性物质和潜在活性物质。本申请能够在宽场显微镜低倍物镜下准确快速进行定量FRET测量，满足高通量要求，并在活细胞中筛选出活性化合物。

主权项：1.一种基于FRET双杂交分析的活细胞药物筛选方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一、在多孔板上使用转染FRET标准质粒的细胞样本进行预实验确定实验条件：确定细胞接种密度；确定成像物镜；确定激发光强；确定视野分析范围；测量宽场荧光显微镜的FRET系统校准参数a、b、c、d、G、k、εAεD；其中，a、b、c、d为光谱串扰系数，G为敏化淬灭转化因子，k是不存在FRET时相等浓度的供体与受体荧光强度比，εAεD为受体和供体摩尔消光系数之比；步骤二、根据预实验确定的实验条件进行基于FRET双杂交分析的活细胞药物筛选：依照预实验确定的细胞接种密度，将基因标记药物靶蛋白质粒转染的细胞在多孔板上进行培养，直至细胞表达供受体蛋白，设置药物组和对照组；所述药物组包含多种药物处理的细胞组，同一种药物处理的细胞组有多组实验；对照组也有多组实验；在预实验确定的成像物镜和激发光强实验条件下，将药物组和对照组置于宽场荧光显微镜下进行FRET三通道成像；所述FRET三通道包括DD通道、AA通道和DA通道；对FRET三通道成像，剔除任一通道信号背景比低于第二信号背景比阈值的细胞数据，然后在预实验确定的视野分析范围内计算以供体为中心的FRET效率ED、以受体为中心的FRET效率EA和受供体浓度比Rc，并绘制ED-Rc图和EA-1Rc图；使用ED-Rc与EA-1Rc线性分离的FRET双杂交分析法得到以供体为中心的FRET最大效率EDmax、以受体为中心的FRET最大效率EAmax和化学计量比NAND；计算ED-Rc图和EA-1Rc图的饱和指标sRatio对药物组和对照组的数据进行筛选；基于筛选后数据对药物组和对照组进行显著性差异检验，得到药物组中的活性物质和潜在活性物质。

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