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申请/专利权人：吉林大学

摘要：一种可检测猪旋毛虫早期感染的荧光免疫层析试纸条及其制备方法，属于血清学检测技术领域。为了更快速、方便、灵敏地检测旋毛虫感染，本发明所述的试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原，所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML‑ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML‑ESP抗原组成；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。本发明可用于旋毛虫现场快速检测。

主权项：1.一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述样品垫设有加样孔；所述结合垫喷涂有荧光探针，所述荧光探针包括作为指示探针的时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG和作为捕获探针的时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原；所述旋毛虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原组成；所述层析膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂有鼠抗猪IgG，质控线上喷涂有兔抗山羊IgG；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜SB-06；所述试纸条的制备方法包括如下步骤：1旋毛虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1-3:1的质量比混合，获得旋毛虫ES混合抗原；2结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针和时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针按照10:1-5:1的质量比喷涂于结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；3检测线和质控线的制备：将鼠抗猪IgG抗体与兔抗山羊IgG抗体按照2:1的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，真空干燥2-3h，密封保存备用；4试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条；所述时间分辨荧光微球偶联旋毛虫ES混合抗原荧光探针的制备方法如下：每14000g1％wv的时间分辨荧光微球经离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入PH为6.1，浓度为0.025molL的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL，浓度为10mgmL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS1.5μL，浓度为10mgmL的1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺EDC1μL和浓度为10mgml的时间分辨荧光微球10μL混匀，搅拌孵育1~2h；待反应结束，离心后弃上清，使用PH=7浓度为0.05molL的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀后加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mgmL的旋毛虫ES混合抗原，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05molL磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mLProclin300，BSA10g和聚乙二醇40020g；步骤2）所述喷涂荧光探针的点样速度为10μLcm；步骤3）所述检测线喷涂鼠抗猪IgG的点样速度和质控线喷涂兔抗山羊IgG的点样速度均为0.8μLcm；所述试纸条使用的封闭剂为含有质量分数2%的BSA的磷酸缓冲液；所述试纸条在使用时，样品稀释倍数为100倍；步骤2）所述时间分辨荧光微球偶联山羊抗兔IgG荧光探针的制备方法如下：每14000g1％wv的时间分辨荧光微球经离心后弃掉保存液中的甘油和磷酸盐；加入浓度为0.025molL的2-吗啉乙磺酸MES溶液100μL、浓度为10mgmL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS1.5μL、浓度为10mgmL的1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺EDC1μL和浓度为10mgml的时间分辨荧光微球10μL混合均匀后，搅拌孵育45min；待反应结束，离心后弃上清，使用浓度为0.05molL的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀，加入200μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入5μL浓度为1mgmL的羊抗兔IgG抗体，室温孵育2-3h；待反应结束，离心后弃上清，然后，加入200μL质量分数为5％的BSA溶液，室温封闭2h，离心后弃上清，向沉淀中加入200μL储存液重悬；所述偶联储存液为0.05molL磷酸盐缓冲溶液，每升偶联储存液中含有0.5mLProclin300，BSA10g和聚乙二醇40020g。

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