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申请/专利权人：上海市食品药品检验研究院

摘要：本发明公开了一种基于量反应平行线分析的水痘减毒活疫苗病毒滴度PMAxx‑qPCR快速检测方法，将水痘减毒活疫苗工作参考品和供试品进行10倍、100倍和1000倍稀释，制得系列参考品溶液和供试品溶液；取相同体积的系列参考品溶液和供试品溶液，按基于DoE响应曲面设计优化好的PMAxx条件进行样本预处理：使PMAxx终浓度为40～60μM，冰上避光孵育8～12min后置于光解仪中光解15～25min；取预处理的样本进行核酸提取，采用如SEQIDNO.1～2所示的引物对VZV‑F和VZV‑R进行qPCR扩增；以建立的供试品与参考品斜率比值的等效区间判定供试品和参考品剂量反应直线的平行性，最后以量反应平行线法算得供试品的病毒滴度。本发明通过采用构建的系统适用性样本进行同步试验，能指示PMAxx预处理样本时死病毒的有效抑制和活病毒的不受干扰；同时，可基于建立的等效区间判定提供参考品和供试品剂量反应直线平行性的信息；另外，在报告水痘疫苗病毒滴度的同时报告其95％置信区间，利于判断实验误差大小是否在允许范围。本发明的方法特异性强、准确度高、重复性好，可检测范围宽，能覆盖目前国内水痘疫苗注册标准中成品病毒滴度检测范围要求，且操作简单快速、1天内即可完成检测全流程，在检测效率上远优于传统的蚀斑法，还在保障数据准确可靠和报告结果的质量方面也略胜一筹，可作为蚀斑法的有效补充。

主权项：1.一种水痘减毒活疫苗病毒滴度PMAxx-qPCR快速检测方法，基于量反应平行线分析，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取水痘减毒活疫苗工作参考品用PSGC缓冲液进行10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释，得到系列参考品溶液；取供试品用PSGC缓冲液进行10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释，得到系列供试品溶液；步骤二，所述系列参考品溶液和系列供试品溶液的每个溶液取相同体积，分别加入PMAxx使其终浓度为40～60μM，冰上避光孵育8～12min后置于光解仪中光解15～25min；步骤三，核酸提取；步骤四，qPCR检测：采用如SEQIDNO.1～2所示的引物对VZV-F和VZV-R；步骤五，量反应平行线分析：以系列参考品溶液和系列供试品溶液病毒滴度的对数lgPFUml为横坐标，相应溶液经PMAxx预处理后提取的核酸扩增所获得的Ct值为纵坐标，绘制参考品和供试品剂量反应直线；采用建立的供试品与参考品斜率比值的等效区间判定供试品和参考品剂量反应直线的平行性，并以量反应平行线法计算供试品的病毒滴度。

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