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申请/专利权人：山东净清源生物有机肥有限公司

摘要：本发明涉及生物农业技术领域，公开了一种堆肥过程中固氮菌的筛选方法及应用，包括以下筛选步骤：步骤一、堆肥样品准备，以腐烂的农作物茎叶、农作物秸秆为主要原料，泥炭为辅料，按照比例混合配置堆肥样品，待其堆制腐解之后，得到堆肥样品；步骤二、样品采集及生物富集。通过堆肥样品准备、采集及生物富集，确保样品代表性和菌种富集效果，然后经过初筛和复筛，可逐步筛选出具有较高固氮能力的菌株，最后通过活性计算鉴定，确定菌株的固氮活性，为其在堆肥过程中的应用提供可靠依据，这一流程化方法提高了筛选效率，有助于提高堆肥过程中氮素的利用效率，促进有机废弃物的有效转化，同时改善土壤质量。

主权项：1.一种堆肥过程中固氮菌的筛选方法，其特征在于，包括以下筛选步骤：步骤一、堆肥样品准备以腐烂的农作物茎叶、农作物秸秆为主要原料，泥炭为辅料，按照比例混合配置堆肥样品，待其堆制腐解之后，得到堆肥样品；步骤二、样品采集及生物富集将经过步骤一处理制成的样品采用五点取样法进行取样，并在取样完毕之后，分别取保存的土样各5g，然后将其各个土样置于锥形瓶中，向其内添加无菌水和玻璃珠进行振荡处理，得到母液；步骤三、菌株初筛将经过步骤二所得到的母液采用梯度稀释法进行稀释，在对母液稀释完毕之后，分别采用微量移液枪取0.2ml接种于Ashby无氮固体培养基平板中涂布均匀，待接种液被培养基吸收后，倒置培养于对应温度的恒温恒湿培养箱中进行培养；步骤四、菌株复筛将经过步骤三筛选出来的菌株接入装有培养基的三角烧瓶中，然后将其置于恒温摇床之上进行振荡培养，在培养结束之后，各取20ml培养的菌液分别注入已灭菌带反口胶塞的注射瓶之中，之后将其进行后续的对照分析，从而完成对菌株的复筛处理；步骤五、活性计算鉴定将上述各项参数带入至以下计算公式中， 式中，hx为样品C2H2峰面积，hs为标准C2H2峰值，C为标准C2H2浓度、单位为nmol·mlL-1,V为试管体积、单位为ml，常数设置为标准C2H2在测试时的体积、单位为ml，t为样品培养时间、单位为h，N为产生的C2H2浓度即固氮酶活性，将不同菌株固氮酶进行活性比较计算，即可筛选出活性最高的菌株，之后工作人员通过形态学鉴定、生理生化鉴定以及分子生物学鉴定对活性最高的菌株进行鉴定，从而对固氮菌株的各项信息进行确认。

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