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申请/专利权人：序康医疗科技(苏州)有限公司

摘要：本发明涉及一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，通过从胚胎早期体外培养液即囊胚培养液中检测胚胎来源的游离DNA，对微量DNA进行均匀的全基因组扩增，再利用二代测序等方法对扩增后的DNA产物进行分析，从而判断胚胎的染色体情况，即是否出现染色体整体或局部的非整倍体。本发明选择囊胚培养液这种体外受精操作过程中胚胎体外培养阶段的废弃物作为检测样本，这种非侵入性无创的方法既避免了常规卵裂球活检或囊胚滋养层细胞活检取样时对胚胎造成的细胞损伤，又不给临床增添额外的麻烦，同时简化了样本获取时的操作，安全可靠性及简便性更高。

主权项：1.一种非诊断和治疗目的的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）囊胚培养液的获得：通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养微滴中进行囊胚培养，将形成囊胚的胚胎吸出，转移至新的囊胚培养液中或者进入玻璃化冻存流程，剩余的原囊胚培养液即检测时所需要收集的样本；（2）囊胚培养液的采集：将步骤（1）中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心后，样本进入下一步的全基因组扩增步骤；（3）囊胚培养液中微量DNA的全基因组扩增：向步骤（2）中获得的囊胚培养液与裂解液的混合物中加入裂解酶，混匀后孵育，而后使裂解酶失活，取出裂解产物加入PCR反应管中进行基因组扩增反应，其中所述裂解酶选自蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1-25μgml，其中，PCR反应时的PCR反应管中含有扩增混合液、0.5%-20%的PCR抑制物对抗剂、5-20mMdNTP、5-100μMNG和NT引物、50-200μM扩增引物、0.5-10单位核酸聚合酶，所述PCR抑制物对抗剂选自DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、Vent聚合酶、DeepVent聚合酶、KlenowFragmentDNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、Phusion®超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E.coliDNA聚合酶、LongAmpTaqDNA聚合酶和OneTaqDNA聚合酶中的一种或多种，其中，所述NG引物从5’到3’为SEQIDNO:2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]的序列，所述NT引物从5’到3’为SEQIDNO:3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]的序列，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸；所述扩增引物从5’到3’为SEQIDNO:6[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]的序列，其中全基因组扩增的热循环程序如下所述：①在第一变性温度95℃下反应10s；②在第一退火温度10℃下反应45s，在第二退火温度20℃下反应45s，在第三退火温度30℃下反应60s，在第四退火温度40℃下反应45s，在第五退火温度50℃下反应45s；③在第一延伸温度62℃下反应90min；④在第二变性温度95℃下反应20s；⑤在第六退火温度59℃下反应20s；⑥在第二延伸温度72℃下反应3min；⑦重复步骤（4）到（6）10至30个循环；⑧在72℃下继续延伸反应5min；⑨将扩增后的产物在4℃下冷藏保存；以及（4）将全基因组扩增后的DNA产物进行分析，以鉴定胚胎的染色体状态是否正常：分析时采用二代测序、核酸芯片或者免疫荧光检测。

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