买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：江苏海洋大学;蓝湾海洋资源开发技术创新中心

摘要：本发明涉及酶固定化技术领域，具体公开了一种基于噬菌体及巯基磁珠的生物催化合成酶的固定化方法，该方法将T4噬菌体衣壳与磁性颗粒结合在一起，用于固定化生物催化合成酶，T4噬菌体衣壳是一种天然纳米粒子，由主要衣壳蛋白gp23和两种非必要蛋白组成，即高抗原性外衣壳蛋白Hoc，155个拷贝衣壳和小外衣壳蛋白Soc，870个拷贝衣壳。本发明将酶设计成Hoc或Soc的融合蛋白，并通过亲和反应自组装到T4噬菌体表面的Hoc或Soc结合位点阵列中，作为安全环保的纳米颗粒，具有高比表面积的纳米颗粒；固定化酶的阵列显示；酶三维结构和活性的良好保持等优点。使用该磁性载体固定化的BnLTA酶具有回收方式简单高效的特点。

主权项：1.一种基于噬菌体及巯基磁珠的生物催化合成酶的固定化方法，其特征在于：该固定化方法的具体步骤包括：S1、磁珠改性：涡旋并振荡商品化的巯基磁珠溶液使其充分混匀；S11、取500μL磁珠混悬液于1.5mL的离心管中，并置于磁力架上；S12、待溶液完全澄清后，缓慢移除上清并加入1mL偶联液，涡旋混匀，使用磁力架吸附磁珠并移除上清，重复三次；S13、将巯基磁珠置于含1.25mL的偶联液、5mgSulfo-SMCC和231.25mg的无水硫酸钠的溶液中，在25℃的恒温摇床中以75转分钟的转速活化过夜；S2、Soc蛋白缺失的T4噬菌体衣壳的制备：S21、将大肠杆菌P301在含无抗性LB培养基的平板上划线，并置于37℃恒温箱中过夜培养；S22、次日，从平板上挑取单克隆接种于含10mL无抗性LB培养基的培养瓶中培养，随后扩大培养体积至500mL，当扩大培养的菌液OD600达到0.4-0.6时，迅速加入1mL的10am13amHoc-Soc-T4噬菌体，随后将锥形瓶放入37℃恒温摇床中，以150rpm培养7min；S23、再次加入1mL10am13amHoc-Soc-T4噬菌体并置于37℃恒温培养箱中以150rpm培养33min；以7000rpm离心12min收集沉淀，随后加入40mLPI-Mg溶液、10μgmLDNaseI以及2mL氯仿，在37℃的恒温摇床中以150rpm孵育30-60min，使大肠杆菌充分裂解；以6000rpm离心10min，保留上清，再以7000rpm离心10min，保留上清，最后以17000rpm离心45min并收集沉淀；S24、向沉淀中加入5mL缓冲液，充分重悬，随后以7000rpm离心10min，收集上清液；再以17000rpm离心45min并收集沉淀，最后向沉淀中加入20mM、pH＝7.5的5mLTris-HCl重悬，并流过DEAE阴离子交换柱，流穿液置于4℃冰箱保存；S3、改性磁珠结合T4噬菌体衣壳：S31、取500μL改性磁珠加入离心管中，随后将离心管置于磁力架上，使用pH＝8.0的0.1M磷酸盐缓冲液清洗三次；S32、随后向离心管中加入1mL用偶联液重悬的T4衣壳和740mg无水硫酸钠，将离心管放入25℃的恒温摇床中，以75rpm的转速震荡6h；S4、与Soc蛋白融合的重组酶的表达质粒构建及原核表达：S41、使用分子克隆手段将编码酶的基因序列与编码RB69噬菌体Soc蛋白的基因序列整合在同一个读码框下，Soc蛋白的编码序列置于酶基因序列的上游或下游，并置于重组表达载体pET-28a+的T7启动子下游，使整个基因片段表达为N端或C端融合Soc蛋白的重组酶，并通过测序确认；S42、将测序成功的重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21DE3感受态细胞，挑取单克隆活化扩大直到培养基OD600达到0.6-0.8时添加IPTG进行诱导；S43、将诱导后的菌液以7500rpm离心5min收菌，随后加入适量25mMTris-HCl、300mMNaCl缓冲液重悬菌体，并用高压破碎仪对菌体进行破碎，以15000rpm离心50min收集含有重组酶的上清液，重组酶可直接进行固定化或视情况经过一轮Ni-NTA纯化柱亲和层析纯化后进行固定化；S5、与Soc蛋白融合的重组酶在噬菌体-磁珠材料上的固定化：S51、将制备成功的载体置于磁力架上，用pH＝8.0的0.1M磷酸盐缓冲液清洗三遍，随后加入25％脱脂牛奶以及磷酸盐缓冲液在25℃下孵育6h；S52、孵育完全后移除上清液并将沉淀重悬于PI-Mg缓冲液中，并加入带有N端或C端融合Soc蛋白的重组酶，置于16℃反应1h，随后将固定化酶储存于0.1M磷酸盐缓冲溶液中，4℃保存。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江苏海洋大学 蓝湾海洋资源开发技术创新中心 一种基于噬菌体及巯基磁珠的生物催化合成酶的固定化方法