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申请/专利权人：首都儿科研究所

摘要：本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR‑Cas12a系统的流感嗜血杆菌的快速检测方法，包括：将流感嗜血杆菌的目的基因采用多交叉置换扩增MCDA技术进行扩增，得到扩增产物；将扩增产物采用簇状规则间隔短回文重复序列相关蛋白CRISPR‑Cas12a系统进行检测。针对现有检测技术难以快速对流感嗜血杆菌进行检测的问题，公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的流感嗜血杆菌的检测方法能够准确、快速、超灵敏、高特异性检测流感嗜血杆菌。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的基于CRISPR-Cas12a系统的流感嗜血杆菌的检测方法，其特征在于，包括：提取目的基因的基因组DNA；利用多交叉置换扩增方法对所述基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；其中，所述多交叉置换扩增的方法使用的扩增引物包括置换引物对、第一扩增引物对、第二扩增引物对、第三扩增引物对和交叉引物对，其中，所述交叉引物对包括插入了PAM序列的正向交叉引物和反向交叉引物；gRNA和CRISPR-Cas12a蛋白形成复合物；所述复合物与所述扩增产物形成三元复合物并对单链DNA探针分子进行切割，得到剪切产物；利用荧光基团和淬灭基团对剪切产物进行标记；利用标记后的剪切产物进行荧光检测；所述置换引物对包括正向置换引物和反向置换引物；其中，所述正向置换引物为Hi-F1，所述Hi-F1的序列如SEQIDNO.1所示；其中，所述反向置换引物为Hi-F2，所述Hi-F2的序列如SEQIDNO.2所示；所述交叉引物对包括正向交叉引物和反向交叉引物；其中，所述正向交叉引物为Hi-CP1，所述Hi-CP1的序列如SEQIDNO.3所示；其中，所述反向交叉引物为Hi-CP2，所述Hi-CP2的序列如SEQIDNO.4所示；所述第一扩增引物对包括第一反向扩增引物和第一正向扩增引物；其中，所述第一反向扩增引物为Hi-D1，所述Hi-D1的序列如SEQIDNO.5所示；其中，所述第一正向扩增引物为Hi-D2，所述Hi-D2的序列如SEQIDNO.6所示；所述第二扩增引物对包括第二反向扩增引物和第二正向扩增引物；其中，第二反向扩增引物为Hi-C1，Hi-C1的序列如SEQIDNO.7所示；其中，第二正向扩增引物为Hi-C2，Hi-C2的序列如SEQIDNO.8所示；所述gRNA的序列如SEQIDNO.11所示；所述ssDNA荧光探针分子的序列如SEQIDNO.12所示。

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