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申请/专利权人：广东赛尔生物科技有限公司

摘要：本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种耳后皮肤来源的成纤细胞的培养方法及培养基。本发明公开了一种耳后皮肤来源的成纤维细胞培养基，所述培养基的组成包括：基础培养基和外源添加物组合物，基础培养基为DMEM培养基或F12培养基或DMEM培养基与F12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基，外源添加物组合物为多种成分的组合。本发明通过合理配伍，得到的培养基及对应的培养方法能够实现纤维细胞的快速增殖培养，缩短培养时间，提高细胞活力。

主权项：1.一种耳后来源的成纤细胞的培养方法，其特征在于，采用一种耳后皮肤来源的成纤维细胞培养基进行培养，所述培养基的组成包括：基础培养基和外源添加物组合物，所述基础培养基包括以下之一：（i）DMEM培养基；（ii）F12培养基；（iii）DMEM培养基与F12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基；所述外源添加物组合物包括谷氨酰胺10~50ngmL、地塞米松1~10µM、香芹酚10~50ngmL、成纤维细胞生长因子1~20μgmL、表皮细胞生长因子1~20μgmL、异丙肾上腺素1~5µM、阿魏酸1~5ngmL、转铁蛋白100~200μgmL、转化生长因子-β1~10μgmL和六肽-21~5ngmL；所述培养方法包括以下步骤：S1：组织采集：无菌条件下取耳后皮肤组织剪碎，然后置于消化酶液中消化，消化后离心，将所得细胞洗涤、离心，重复3次，得到细胞悬液；S2：原代培养：使用原代培养基重悬细胞，使细胞浓度为2~4×105个mL，在含有5％CO2、37℃的培养箱中培养5-10天，其中，每隔2-3天换一次培养基；S3：成纤细胞的扩增培养：将步骤S2中的原代培养结束后弃去培养基，加入1~2mL分散酶37℃下静置30min，然后离心弃去上清，再使用1~2mL胰蛋白酶-EDTA消化5min，然后使用成纤维细胞培养基重悬细胞得到浓度为1~4×105个μL的细胞悬液10~20μL，再加入25~40μL增殖基质胶混合，待增殖基质胶凝固后，再次加入1~2mL的成纤维细胞培养基，最后在含有5％CO2、37℃的培养箱中培养10~15天，其中，培养期间每隔2~3天换一次培养基；步骤S2中所述原代培养基的组成包括：基础培养基和外源添加物组合物，所述基础培养基包括以下之一：（i）DMEM培养基；（ii）F12培养基；（iii）DMEM培养基与F12培养基按照体积比为1~2:1~2组成的混合培养基；所述外源添加物组合物包括谷胱甘肽10~20μgmL、氢化可的松1~10μM、碱性成纤维细胞生长因子1~10ngmL、重组人表皮细胞生长因子1~10ngmL、异鼠李素1~5ngmL、肌醇六磷酸1~10ngmL、类胰岛素生长因子-II5~20ngmL、磷酸腺苷50~150ngmL、皮质醇20~50ngmL、转化生长因子-β10~20ngmL、白细胞介素IL-11~5ngmL、硫酸亚铁2~15ngmL和精氨酸1~5μgmL；步骤S3中所述增殖基质胶的制备方法包括：将明胶溶解于水中得到质量含量为40~60%的胶液，然后加入磷酸氢二铵，在150~200℃下加热反应1~3h，待反应结束后冷却至室温，得到改性明胶；将所得改性明胶与N,N-二甲基甲酰胺、乙烯基磺酸盐单体按照质量比1:50~100:1~10的量混合均匀，在引发剂的存在下，40~60℃下反应2~6h，保持温度不变再加入硅烷偶联剂反应1~5h，待反应结束后冷却至室温，静置2~6h，随后抽滤，将所得胶状物采用去离子水洗涤，得到所述增殖基质胶。

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