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申请/专利权人：广东海洋大学

摘要：本发明申请属于病毒影响血睾屏障技术领域，具体公开了一种猪瘟病毒影响公兔血睾屏障渗透性功能的检测方法，包括以下材料的准备：公兔睾丸组织、基因拷贝数为1×105.5μL的CSFV病毒液、1XPBS缓冲液、4KDa的FITC标记葡聚糖荧光素、96孔避光板、显微镜、荧光显微镜、酶标仪；猪瘟病毒影响公兔血睾屏障渗透性功能的检测方法具体包括以下步骤：公兔攻毒、配制FITC工作液、睾丸组织摘取、FITC‑葡聚糖向睾丸组织内的渗透等步骤。检测体系缩短了全套试验的时间，大大提升了结果的准确性，有效解决了对公兔血睾屏障渗透性功能完整快速检测的问题。

主权项：1.一种猪瘟病毒影响公兔血睾屏障渗透性功能的检测方法，其特征在于，包括以下材料的准备：公兔睾丸组织、基因拷贝数为1×105.5μL的CSFV病毒液、1XPBS缓冲液、4KDa的FITC标记葡聚糖荧光素、96孔避光板、显微镜、荧光显微镜、酶标仪；猪瘟病毒影响公兔血睾屏障渗透性功能的检测方法具体包括以下步骤：1公兔攻毒：取基因拷贝数为1×105.5μL的CSFV病毒液室温融化，通过腹腔注射病毒液感染公兔，每只兔注射5mL病毒液；2配制FITC工作液：避光环境下称取5mg4KDa的FITC标记葡聚糖荧光素溶解于1mL1XPBS缓冲液，得到5mgmL的FITC工作液；3睾丸组织摘取：将步骤1中感染的公兔在出现体温反应后麻醉处死，沿腹部切开外皮，创口约6cm；夹住近心侧睾丸末端细管，切开包膜，扯出完整连接的睾丸和附睾组织，去除血液，睾丸和附睾组织两端分别夹紧固定，浸泡在1XPBS缓冲液中；4FITC-葡聚糖向睾丸组织内的渗透：将台盼蓝染料注射入睾丸中，等待台盼蓝渗透后，注射器吸取步骤2得到的FITC工作液5mL，从睾丸与附睾连接处注射，注射后将睾丸放置在含1mL1XPBS的培养皿中，在避光条件下等待FITC-葡聚糖由外部渗透到睾丸组织内；5公兔曲细精管剥离：取步骤4得到的渗透后的睾丸，切开鞘膜腔，暴露曲细精管，剪下1cm×1cm的曲细精管簇，放入含有1XPBS缓冲液的培养皿中；显微镜观察下在曲细精管簇破碎端抽取4X视野直径等长的曲细精管，确认形态无折痕或压痕后用镊子压断两端；6曲细精管压片观察荧光分布与强度：提前向载玻片中间滴适量1XPBS缓冲液，取步骤5中剥离的曲细精管片段，制作压片；盖上盖玻片后，吸干盖玻片四周溢出水分后，在荧光显微镜下观察荧光在曲细精管中的定位和扩散情况；7曲细精管内FITC-葡聚糖由管内向PBS扩散：取步骤5中剥离的曲细精管片段放入新的含1XPBS缓冲液的容器中，避光条件下等待曲细精管内的FITC-葡聚糖向外部PBS扩散，扩散完成后将曲细精管置于含一滴1XPBS缓冲液的凹面载玻片上，观察FITC工作液在曲细精管内外的分布；8PBS中渗出的FITC-葡聚糖的荧光强度的检测：移液枪取200μL渗透后的PBS缓冲液加到96孔避光板中，在酶标仪下检测波长485-528nm范围下的荧光强度。

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