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申请/专利权人：广东一方制药有限公司

摘要：本发明公开了一种用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重PCR鉴别的引物，其包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；其中，第一引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：2所示；第二引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：3所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：4所示；第三引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：5所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：6所示。本发明还公开了上述引物的应用，以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明，可同时有效鉴别金钱白花蛇、赤链蛇和金环蛇。

主权项：1.一种金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂及金钱白花蛇中药配方颗粒多重PCR鉴别方法，其特征在于，包括：取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8mL的CTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μLCTAB沉淀液、15～25μL蛋白酶K，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μLCTAB提取液，5～15μLβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μL，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μL，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μL灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组DNA；其中，所述CTAB沉淀液的组成为：2％wvCTAB，100mmolLTris-HCl，20mmolLEDTA；所述CTAB提取液的组成为：2％wvCTAB，100mmolLTris-HCl，20mmolLEDTA，2.5molLNaCl，20％wvPVP40；其中，Tris-HCl、EDTA的pH均为8.0；以所述基因组DNA为模板，采用第一引物对、第二引物对、第三引物对进行PCR扩增，若扩增产物中含有160bp的DNA条带，则待检测样品含有金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂和或金钱白花蛇中药配方颗粒；若扩增产物中含有207bp的DNA条带，则待检测样品含有赤链蛇药材、赤链蛇标准汤剂和或赤链蛇中药配方颗粒；若扩增产物中含有191bp的DNA条带，则待检测样品含有金环蛇药材、金环蛇标准汤剂和或金环蛇中药配方颗粒；所述第一引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：3所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：4所示；所述第三引物对的上游引物的序列如SEQIDNO：5所示，其下游引物的序列如SEQIDNO：6所示；PCR扩增体系由下述物质组成：PCR预混液12.5μL；第一引物对的上游引物、下游引物各0.3μL，第二引物对的上游引物、下游引物各0.3μL，第三引物对的上游引物、下游引物各0.3μL，模板1μL，ddH2O9.7μL；所述PCR扩增程序为：将PCR扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环35次，最后在72℃延伸5min；其中，所述预设程序为：将PCR扩增体系在95℃变性30s，然后在61℃退火30s，再在72℃延伸30s。

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