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申请/专利权人：中山大学·深圳

摘要：本发明公开了一种装载小分子化疗药物且TIGIT过表达的工程化载药细胞膜囊泡的制备方法及其应用，包括如下步骤：S1.包装病毒，制备、收集特定的编码TIGIT基因的慢病毒溶液；S2.用所得慢病毒溶液感染目的细胞，并使用抗性药物筛选，从而构建过表达TIGIT基因的稳定细胞系；S3.培养所得稳定细胞系，提取其细胞膜并将其制成膜纳米囊泡，离心纯化，得工程化细胞膜囊泡；S4.用所得细胞膜囊泡装载小分子化疗药物，离心纯化后，即得工程化载药细胞膜囊泡。本发明所制备的工程化载药细胞膜囊泡生物安全性好，在肿瘤的免疫治疗中显示出优异的效果，具有较好的临床转化价值和应用前景。

主权项：1.一种装载化疗药物且TIGIT过表达的工程化载药细胞膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.包装慢病毒，于37℃细胞培养箱中培养HEK-293T细胞，按照体积比例1:（1.2~1.5）:（2~4）加入混合好的目的质粒、包装质粒以及lipo2000，目的质粒为编码TIGIT基因的质粒，5-9小时后换液，继续使用正常的完全培养基培养，收集培养上清，离心去除细胞，继续收集上清，过滤除去上清中的细胞碎片，而后将滤液与病毒纯化试剂按照1:4的体积比混合，孵育之后3000g~4000g离心20-30min，去除上清，用BS重悬沉淀即得所需慢病毒溶液；其中编码TIGIT的基因序列号为：NM_001146325.1；S2.于细胞培养箱中培养目的细胞，目的细胞为NIH3T3细胞，然后用所得的慢病毒溶液感染NIH3T3细胞，感染后用嘌呤霉素筛选细胞，1-2周后进行检测，选出TIGIT过表达的细胞，构建TIGIT过表达的稳定细胞系即TIGIT过表达的NIH3T3细胞系；S3.培养所得的稳定细胞系，收集清洗后，破碎形成匀浆液，将匀浆液离心提取其细胞膜，并将其制成膜囊泡，离心纯化，得工程化细胞膜囊泡；S4.通过共孵育或超声方法将所得细胞膜囊泡装载小分子化疗药物，离心纯化之后，即得工程化载药细胞膜囊泡；所述S4.中，通过共孵育或超声方法实现奥沙利铂的装载，其中工程化细胞膜囊泡和奥沙利铂溶液混合后的最终浓度分别为1mgml和1-1.5mgml，混合物在37℃共孵育或在冰上超声得到对应的混合体系，然后将混合体系使用超速离心机或超滤管进行离心，得到工程化载药细胞膜囊泡。

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