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申请/专利权人：浙江农林大学

摘要：本发明涉及一种香榧雌球花花腐病病原菌鉴定及防治应用方法，具体包括以下步骤：病原菌分离纯化：采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，首先对患病雌球花进行75％酒精浸泡5s，然后采用2％次氯酸钠浸泡2min进行消毒处理，随后使用无菌水漂洗3遍晾干后，再对切雌球花，挑取雌球花内部珠心病健交接处组织，置于PDA培养基上，25℃培养，然后进行分离纯化；通过科赫法则、形态学和分子生物学鉴定得出可引起香榧雌球花发生黄化褐腐的病原菌种类。通过在花期喷施药剂防治该病原菌对雌球花的侵染，防治效果可以通过田间观察雌球花发病症状和调查其发病率，通过对感病时期的空气孢子浓度监测及雌球花发育进程及发病规律观察，明确雌球花对该病害的易感染时期，并在最佳药剂防治时期通过喷施有效杀菌剂来防治致病菌导致的落花，提高香榧产量。

主权项：1.一种香榧雌球花花腐病病原菌鉴定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：病原菌分离纯化：采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，首选对患病雌球花进行75％酒精浸泡5s，然后采用2％次氯酸钠浸泡2min进行消毒处理，随后使用无菌水漂洗3遍晾干后，再对切雌球花，挑取雌球花内部珠心病健交接处组织，置于PDA培养基上，25℃培养，然后进行分离纯化；采用孢子悬浮液为将供试的菌株接入新PDA平板，PDA培养基上在25℃的黑暗环境下培养7天，然后在无菌条件下，加入适量无菌水，轻轻刮取后，进行洗脱、过滤以及离心1000rmin5min，然后倒去上清液，加入无菌水，再次离心，最后用无菌水将孢子重悬浮，并加入Tween200.1％vv，配置成1×106个·mL-1的孢子悬浮液；科赫法则鉴定：对消毒处理后带有传粉滴的雌球花枝条进行孢子悬浮液喷雾回接，以无菌水作为对照，在无菌玻璃皿中保湿培养，观察记录发病情况，喷施孢子悬浮液处理组的雌球花花腐病发症症状与田间症状一致，且从患病雌球花样本中分离出回接病原菌，再次重新纯化后，对其进行形态学和分子生物学鉴定，重新分离到相同菌株，则确定该病原菌是导致香榧雌球花花腐病的致病菌；形态学鉴定：将纯化的菌株接种在PDA，PSA,OA和MEA培养基上，25℃黑暗条件下培养7天，观察并拍照记录菌落形态、大小、颜色与分生孢子的形态、大小；分子生物学鉴定：采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提取试剂盒提取分离纯化的致病菌株的DNA，然后选择引物ITS1ITS4、ACT512FACT783R和EF1-728FEF1-986R对菌株的ITS、ACT和EF-1ɑ进行PCR扩增，测序结果经过GeneBank数据库进行同源性比对分析。

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