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申请/专利权人：江西农业大学
摘要：本发明公开了一种永生化猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法与应用，属于基因编辑技术领域。所述永生化猪胎儿成纤维细胞系的构建方法如下：1CRISPRCas9打靶载体的构建；2SV40‑LT永生化定点整合载体的构建；3细胞转染；4阳性细胞筛选。利用该构建方法构建得到的永生化猪胎儿成纤维细胞系，细胞形态不发生明显改变，传代100次后，未发生细胞周期停滞的现象。所述永生化猪胎儿成纤维细胞系在构建BFP‑imPFF荧光报告细胞系中的应用，BFP‑imPFF荧光报告细胞系可替代原代PFF细胞，实现PFF细胞基因编辑技术体系的快速优化。本发明填补了永生化猪胎儿成纤维细胞系相关研究领域的空白。
主权项：1.一种永生化猪胎儿成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，步骤如下：1CRISPRCas9打靶载体的构建：针对猪pH11安全港位点设计并人工合成sgRNA，sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；将sgRNA连接到px459-V2.0载体上，得到pH11-sgRNA-PX459打靶载体；2SV40-LT永生化定点整合载体的构建：人工合成携带有左同源臂、EF1α启动子、SV40-LT基因、polyA、CMV启动子、NeoR抗性基因和右同源臂的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述左同源臂与sgRNA的5’端序列同源，右同源臂与sgRNA的3’端序列同源；然后构建到pUC-Mini载体的Eco53KI酶切位点，得到pH11-SV40-LT永生化定点整合载体；3细胞转染：取原代猪胎儿成纤维细胞，培养至汇合度达到80％～90％，使用胰酶消化细胞，加入pH11-sgRNA-PX459打靶载体和pH11-SV40-LT永生化定点整合载体，进行电转染；4阳性细胞筛选：电转染后，利用G418进行筛选，富集定点整合阳性细胞，即得永生化猪胎儿成纤维细胞系。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 江西农业大学 永生化猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法与应用
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