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申请/专利权人：西北农林科技大学

摘要：本发明公开了一种通过基因编辑ClHAP2创制二倍体无籽西瓜的方法，属于植物基因工程育种技术领域。本发明首次利用CRISPRCas9技术，对西瓜ClHAP2基因进行靶向编辑，使其基因功能缺失，精卵细胞无法正常融合导致种子败育，从而在二倍体水平创制无籽西瓜。通过本方法创制的二倍体无籽西瓜编辑植株与野生型材料相比，除了雌雄配子不育，营养生长阶段表型均无发生明显变化，植株可以通过自交偶尔产生的种子或Clhap2ClHAP2杂合编辑植株无限繁殖。该方法仅利用突变体花粉给不同西瓜种质授粉就可在当代获得无籽西瓜，具有简单易操作、效率高、成本低和周期短等优点。

主权项：1.一种通过基因编辑ClHAP2创制二倍体无籽西瓜的方法，其特征在于，具体步骤如下：1根据ClHAP2CDS序列设计靶点gRNA1、gRNA2、gRNA3；2构建ClHAP2CRISPRCas9双靶位敲除载体；gRNA1和gRNA2组合双靶点；1利用限制性内切酶BsaI-HF对CRISPRCas9载体pBSE402进行酶切，回收酶切后的载体pBSE402；2以中间载体pCBC-DT1T2为模板，利用引物Target1-FTarget2-R进行PCR扩增，回收目的片段；3将步骤1酶切后的载体pBSE402与步骤2回收的目的片段进行同源重组，转化DH5α感受态；4将步骤3得到的菌落分别摇菌并抽提重组质粒，测序比对，将测序正确的重组质粒分别转化至农杆菌EHA105感受态中；5将步骤4得到的菌落进行PCR检测，验证正确后进行西瓜遗传转化；3构建ClHAP2CRISPRCas9gRNA3单靶位敲除载体；1利用引物Target3-FTarget3-R进行双链引物退火；2以退火后的引物和载体pBSE402在限制性内切酶BsaI-HF和T4Ligase连接酶的作用下进行边酶切边连接的反应；3将步骤2得到的产物转化DH5α感受态；4将步骤3得到的菌落分别摇菌并抽提重组质粒，测序比对，将测序正确的重组质粒分别转化至农杆菌EHA105感受态中；5将步骤4得到的菌落进行PCR检测，验证正确后进行西瓜遗传转化；4西瓜遗传转化经过侵染、共培养、恢复培养、选择培养、芽伸长培养和生根培养阶段得到转基因植株；5将步骤4获得的转基因植株进行基因编辑检测，将基因编辑植株移栽至试验田进行无籽表型观察。

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