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申请/专利权人：浙江大学杭州国际科创中心;北京全式金生物技术股份有限公司

摘要：本发明公开了一种TaqDNA聚合酶突变体及其筛选方法，该TaqDNA聚合酶突变体与未经改造的野生型Taq酶相比，特异性和活性均有明显的提高，可极大程度满足研究和医学诊断应用需求。本发明还公开了一种改进后的CSR方法，简化了乳化过程和回收ePCR产物过程，使得目前操作步骤繁琐的CSR更简化；而且摒弃之前的方法中使用氯仿、苯酚和异丙醇的有毒有害试剂，让过程更环保和容易操作。

主权项：1.一种筛选得到TaqDNA聚合酶突变体的分隔式自我复制方法，其特征在于，包括以下步骤：1构建饱和突变文库：以含有TaqDNA聚合酶的环状质粒作为模板，进行PCR扩增，构建TaqDNA聚合酶定点饱和突变质粒文库；所述环状质粒的PCR体系为：模板1μL，引物F10μM1μL，引物R10μM1μL，dNTP2.5mM4μL，高保真酶缓冲液5μL，高保真酶1μL，补水至50μL的反应体系；引物F的序列为GCCGCCGTTATGTACCGNNKCTGGAAGCTCGCG；引物R的序列为AACGCGAGCTTCCAGMNNCGGTACATAAC；PCR热循环条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，Tm-5℃退火20s，72℃延伸4min20s，4℃保温；进行PCR扩增35个循环；2突变体文库的诱导表达：将步骤1获得的定点饱和突变质粒转入大肠杆菌细胞中，进行诱导表达，得到菌悬液；3乳化PCR：配制ePCR预混液，将ePCR预混液加入至CSR油相中，并在乳化过程中，向混合物中放入橡胶颗粒，得到单相的乳白色粘稠的乳液；ePCR预混液的配方为：10×PCRbuffer40μL，dNTP2.5mM40μL，2CSR-F8μL，2CSR-R8μL，菌体0.5OD，ddH2O304μL；2CSR-F的序列为：GCGGCAAAAACCATCAACTTCGGTGTTC；2CSR-R的序列为CTCCAGCGGTACCGCAAGTGGGTAGAC；4乳化PCR产物回收与扩增：采用PCR产物回收试剂盒回收乳化的PCR产物，并进行扩增反应；5连接转化与测序，得到TaqDNA聚合酶突变体；所述TaqDNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；编码TaqDNA聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

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