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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明公开了一种基于三叶斑潜蝇LtHsp20.8的重组质粒。本发明还公开了一种重组三叶斑潜蝇热激蛋白及其在应对外界热胁迫功能方面的应用。本发明还公开了一种基于大肠杆菌的生长活性检测三叶斑潜蝇热激蛋白应对外界热胁迫功能的方法。本发明方法通过对表达重组LtHsp20.8蛋白的大肠杆菌进行热胁迫处理，并对其生长OD600值和单菌落数目进行观察，以此反应热胁迫下重组Hsps蛋白的大肠杆菌的生长是否具有抑制或其他作用，间接证明了重组热激蛋白能否增加大肠杆菌对高温的耐受性，从分子层面为研究温度胁迫下三叶斑潜蝇热激蛋白的保护机制具有十分重要的意义。

主权项：1.一种基于大肠杆菌的生长活性检测三叶斑潜蝇热激蛋白应对外界热胁迫功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）基于三叶斑潜蝇LtHsp20.8的开放阅读框设计特异性引物对，进行目的片段扩增、PCR产物回收，得到带有目的基因的PCR产物；所述LtHsp20.8序列为SEQIDNO.1；所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；（2）将步骤（1）中所述的带有目的基因的PCR产物和原核表达载体质粒进行连接，转化，培养，提取质粒；所述连接的体系为LigaseBuffer、DNA、pET28a载体和T4DNALigase；连接用到的连接酶为T4DNA连接酶；连接前有酶切步骤，所述酶切的体系为NEBBuffer、EcoRI、XhoI、DNA和ddH2O；（3）将步骤（2）中所述的质粒进行转化至大肠杆菌，振荡培养直至OD值为0.5，获得菌液；（4）分别将空载大肠杆菌和步骤（3）中所述的菌液进行诱导表达，并在高温胁迫下振荡培养，获得含有重组三叶斑潜蝇热激蛋白的菌液，实时检测所述空载大肠杆菌的菌液和含有重组三叶斑潜蝇热激蛋白的菌液OD600值，所述高温胁迫的温度为45℃；所述诱导表达的条件为0.5mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷45℃诱导表达6小时；（5）当步骤（4）中所述含有重组三叶斑潜蝇热激蛋白的菌液的OD600值随着培养时间的增加不断显著增加，且整体趋势明显高于空载大肠杆菌的OD600值时，表明重组三叶斑潜蝇热激蛋白有应对外界热胁迫功能。

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百度查询： 扬州大学 基于大肠杆菌的生长活性检测三叶斑潜蝇热激蛋白应对外界热胁迫功能的方法