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申请/专利权人：广西医科大学

摘要：本发明涉及联合标志物技术领域，且公开了一种快速准确诊断早期肾癌的标志物组合，针对肾癌早期诊断率低问题，公开了一组联合诊断早期肾癌和健康对照的代谢标志物，通过对血浆中特异性代谢物谱检测，筛选和建立一种组合的小分子代谢物用于辅助诊断早期肾癌。本发明所提供的方法具有无创、方便、准确的特点，并且能准确反映肾癌患者和健康对照的代谢差异。

主权项：1.一种快速准确诊断早期肾癌的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合的使用方法包括以下步骤：步骤S1：首先进行样本采集；本研究招募早期、在临床上可行手术切除的肾癌患者、以及健康对照；采用EDTA抗凝管获取全血，在4℃条件下以3000rpm离心10min；分离出的血浆应储存在-80℃直至进行进一步实验；步骤S2：对样本进行预处理，包括亲水性物质提取和疏水性物质提取；从-80℃冰箱中取出样本，解冻后在冰上进行后续操作；亲水性物质提取：将样本涡旋混匀后，取50μL加入离心管，再加入300μL20％乙腈甲醇内标提取液，涡旋混合后离心；将上清液转移至另一离心管中，再次离心后取180μL上清液用于上机分析；疏水性物质提取：同样解冻后涡旋混匀，取50μL样本加入离心管，再加入1mL含内标脂质提取液，涡旋混合后离心；将上清液转移至另一离心管中并浓缩至完全干，加入流动相B含0.1％甲酸，10mmolL甲酸铵涡旋混合后再次离心，取上清液用于LC-MSMS分析；步骤S3：设置色谱质谱采集条件，包括亲水性物质提取、疏水性物质提取，进行LC-MS非靶向代谢组学检测和脂质组学检测，液相条件包括色谱柱的选择和流动相的设定，其中亲水性物质采用WatersACQUITYUPLCHSST3C181.8μm色谱柱；疏水性物质采用ThermoAccucoreTMC30色谱柱，流动相为含0.1％甲酸的乙腈水和10mmolL甲酸铵乙腈异丙醇；质谱条件包括电喷雾离子源温度、质谱电压、离子源气体和碰撞诱导电离参数的设置，在Qtrap中优化去簇电压和碰撞能扫描检测离子对；亲水性物质和疏水性物质的质谱条件不同，需分别设置；步骤S4：进行代谢物定性与定量；对数据进行原始数据提取、离子峰鉴定和质量控制评估，基于自建靶向标品数据库MWDB，根据检测物质的保留时间RT、离子对信息及二级谱数据进行定性分析，重点筛选；步骤S5：利用单因素和多变量因素分析方法筛选出具有统计学差异的代谢物；依次进行主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析，根据变量重要性投影和差异倍数值进一步筛选差异代谢物；利用最小绝对收敛和选择算子进行变量筛选和降维，利用逻辑回归分析,构建肾癌的早期诊断模型；步骤S6：检测研究对象的非靶向质谱和非靶向质代谢物谱，输入早期诊断模型，计算患肾癌的风险概率，获得患者的患病风险。

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