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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了一种体内检测ROP蛋白活性的方法，包括1构建融合蛋白表达载体并转化农杆菌感受态细胞；2植物叶片注射；3植物活体成像仪定性检测荧光强度；4酶标仪定量检测荧光素酶活性：使用酶标仪进行荧光扫描，以显示荧火素酶分解底物后产生荧光的强度来判断荧光素酶活性的强弱，从而检测目标蛋白AtROP1的活性强弱的程度。该方法基于RIC1作为ROP蛋白的下游效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点，通过荧火素酶互补实验，借助烟草瞬时表达系统，利用植物活体成像仪和酶标仪进行定性定量检测荧光强度，从而实现体内检测ROP蛋白的活性。同时该方法还具有高灵敏度、可视化、可定量化和操作简单高效等特点。

主权项：1.一种体内检测ROP蛋白活性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：构建融合蛋白表达载体并转化农杆菌感受态细胞：克隆目标基因AtROP1和AtRIC1，将AtROP1、AtRIC1依次分别与双酶切的载体pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc进行连接，获得含有目标基因的重组质粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL；将构建好的重组质粒分别转化到农杆菌感受态细胞并进行抗生素筛选获得含有目标基因重组质粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的农杆菌菌株；植物叶片注射：挑取含有目标基因重组质粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的农杆菌菌株分别在含50μgmL卡那霉素和50μgmL利福平的液体LB培养基中振荡过夜培养至OD600=0.3~0.4，收集菌体并用MES缓冲液重悬菌体，调OD600=1.0时放置于摇床上孵育后得侵染液，将含有目标基因表达载体AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的侵染液按体积比1:1混合，然后将混合的菌液注射至待测植物叶片背面的位置，最后将植物进行培养40~48小时；植物活体成像仪定性检测荧光强度：选取注射完农杆菌40~48小时后的植物叶片，用含1mmolL荧火素底物D-luciferin的反应液喷湿叶片背面，将喷湿的叶片在黑暗中静置后，将其背面向上置于培养皿中，移入植物活体成像系统中检测发光情况；如果有荧光,即说明激活态的AtROP1可以与AtRIC1存在互作，同时也说明该方法可以检测到AtROP1蛋白的活性；酶标仪定量检测荧光素酶活性：选取注射农杆菌40~48小时后的植物叶片，使用酶标仪进行荧光扫描，根据扫描的数值绘制柱形图，以显示荧火素酶分解底物后产生荧光的强度来判断荧光素酶活性的强弱，从而检测目标蛋白AtROP1的活性强弱的程度；所述的目标基因AtROP1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的目标基因AtRIC1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；含有目标基因的重组质粒的构建过程为：以拟南芥花朵cDNA为模板，设计正反向引物进行PCR扩增，从而将AtROP1和AtRIC1基因克隆；将AtRIC1扩增产物与用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切载体pCAMBIA1300-CLuc进行连接获得重组载体AtRIC1-pCL；将AtROP1扩增产物与用BamHⅠ和SalⅠ双酶切载体pCAMBIA1300-NLuc进行连接获得重组载体AtROP1-pNL；所设计的正反向引物序列为：AtRIC1-F：gcgtcccggggcggtaccATGGCGACGACAATGAAGAtRIC1-R：agtccatttgttggatccGATAATATCGTTACAGGTTGTATCAAtROP1-F：ctcggtacccggggatccATGAGCGCTTCGAGGTTCGTAtROP1-R：gtacgagatctggtcgacTAGAATGGAGCATGCCTTCTGC。

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