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申请/专利权人：迈杰转化医学研究(苏州)有限公司

摘要：本申请公开了一种多重扩增子文库的构建方法及其应用。所述方法包括：添加特异性分子标签UMI接头后，通过一端特异性引物和一端通用引物对靶标区域进行两轮半特异引物扩增，并在两轮扩增步骤之间使用核酸外切酶消化剩余引物。利用本发明的扩增子建库方法检测基因变异，两轮半特异引物扩增能够高效利用双链模板，通过UMI对扩增子校准扩增错误或测序错误，提高对于超低频突变的检测灵敏度，方法操作简便省时，成本低，适用于多种扩增子建库应用场景。

主权项：1.一种多重扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）确定待检测的目标区域的参考DNA序列，针对所述目标DNA序列分别设计多重正反向特异性引物；所述多重正反向特异性引物的解链温度的温度差≤5℃；所述多重正反向特异性引物的解链温度的标准差≤5℃；（2）合成目标序列的特异性扩增引物；所述引物合成序列在上述特异性引物的基础上在5’端增加通用序列；所述通用序列为测序接头序列1的3’端20~33bp序列；所述测序接头为Illumina测序平台或MGI测序平台；（3）将步骤（2）合成的所有目标序列的正向特异性引物等摩尔数混合为该目标组合的多重正向混合引物，将步骤（2）合成的所有目标序列的反向特异性引物等摩尔数混合为该目标组合的多重反向混合引物；（4）设计合成通用引物，扩增通用引物的序列为测序接头引物序列3’端的一部分；所述通用序列为测序接头序列2的3’端20~34bp序列；所述测序接头为Illumina测序平台或MGI测序平台，并与步骤（2）中测序接头序列对应同一测序平台；（5）提取样本DNA，并选择性进行片段化，进行末端修复及加腺嘌呤A；所述样本DNA包括基因组DNA或cfDNA中的任意一种；所述cfDNA无需进行片段化；（6）利用连接酶将步骤（5）中选择性片段化后的DNA片段与UMI接头进行连接，得到连接产物；所述的连接酶包括ATP-dependent酶、T4多核苷酸激酶或T4DNA连接酶中任意一种或至少两种的组合；所述UMI接头为Y型双链接头；所述连接的反应时间为10~60分钟；所述UMI接头上带有6~12个随机碱基组成的UMI条形码序列；（7）利用步骤（6）中的连接产物为模板进行第一轮半特异多重扩增，得到第一轮扩增产物，所述第一轮半特异多重扩增引物包括步骤（3）中的多重正向混合引物与步骤（4）中的通用引物；（8）利用核酸外切酶消化步骤（7）反应体系中未使用完的游离引物和或引物二聚体后并将核酸酶进行失活；所述核酸外切酶包括核酸外切酶I、核酸外切酶VII和核酸外切酶V；所述核酸外切酶I和核酸外切酶VII的混合比例为3~1:1；所述核酸外切酶I和核酸外切酶VII的混合物和核酸外切酶V的混合比例为1~20:1；（9）利用步骤（8）中核酸外切酶消化后的产物为模板进行第二轮半特异多重扩增，得到第二轮扩增产物，所述第二轮半特异多重扩增引物包括步骤（3）中多重反向混合引物与步骤（4）中的通用引物；（10）纯化步骤（9）中的第二轮扩增产物；（11）以步骤（10）中纯化后的第二轮扩增产物为模板，进行标签引物扩增加上样本标签，得到扩增子文库，所述标签引物包括Illumina测序平台或MGI测序平台测序双端标签序列引物；（12）对扩增子文库进行纯化、定量、测序。

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