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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了一种基于RCA和DNA聚合酶矫正反应的长链DNA扩增方法，包括：（1）构建多重置换体系A和置换程序，以环状dsDNA为模板，获得Exo‑primer和环状ssDNA的复合结构；（2）构建环化扩增体系B和扩增程序，以步骤（1）得到的复合结构为模板，进行单链环化扩增；（3）构建多重同时位移扩增体系C和扩增程序，以步骤（2）得到的单链环化扩增产物为模板，进行长链dsDNA的扩增，并对扩增产物中的Flags进行剪切形成cleavages；（4）构建DNA聚合酶矫正反应体系和程序，对步骤（3）中得到的产物进行非正常结构的修复。本发明方法可稳定的扩增约200kb的DNA片段，这在克隆、表达和靶向基因组测序等方面有许多应用；该方法极大的扩展了DNA扩增的容量，在生物领域有很大的应用潜力。

主权项：1.一种基于RCA和DNA聚合酶矫正反应的长链DNA扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建多重置换体系A和置换程序，以环状dsDNA为模板，获得Exo-primer和环状ssDNA的复合结构，所述多重置换体系A包括环状dsDNA模板、Exo-primer和DNaseRNase-FreeddH2O，多重置换程序为：95℃10min；95℃15s、28℃30s，共6个循环数；30℃待用；所述Exo-primer为5'端和3'端均为羟基且3'端具有两个硫代磷酸修饰的随机六聚体引物；（2）构建环化扩增体系B和扩增程序，以步骤（1）得到的复合结构为模板，进行单链环化扩增，得到单链环化扩增产物；所述环化扩增体系B包括10×phi29buffer、DTT、BSA、dNTPs、DNaseRNase-FreeddH2O、phi29ase和PPase；环化扩增程序为：30℃10h，轻柔吹吸3-5下，30℃10h，95℃10min；（3）构建多重同时位移扩增体系C和扩增程序，以步骤（2）得到的单链环化扩增产物为模板，进行长链dsDNA的扩增，并对扩增产物中的Flags进行剪切形成cleavages，所述多重同时位移扩增体系C包括10×phi29buffer、DTT、Exo-primer、dNTPs、DNaseRNase-FreeddH2O、phi29ase和PPase；多重同时位移扩增程序为：30℃10h，轻柔吹吸3-5下，30℃10h，65℃15min，4℃待用；对扩增产物中的Flags进行剪切形成cleavages的具体过程为：对扩增产物进行FEN1处理，随后采用CTAB法去除上述步骤（1）-（3）中加入的蛋白酶、dNTPs、DTT、反应buffer，同步离心去除Exo-primer；FEN1处理条件为：65℃3min；（4）构建DNA聚合酶矫正反应体系和程序，对步骤（3）中得到的产物进行非正常结构Flags的矫正修复，DNA聚合酶矫正反应体系包括步骤（3）得到的目标扩增产物、dNTPs、10xThermoPol®ReactionBufferPack、SulfolobusDNAPolymeraseIV、KlenowFragment3’-5’exo–和DNaseRNase-FreeddH2O；DNA聚合酶矫正反应程序为：45℃10min。

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