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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明设计一种提高OMVs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法，国内外未见tolA、tolB、tolR基因影响猪霍乱沙门菌的OMVs生物发生的相关报道，要想开发猪病相关的OMVs疫苗，探索提高猪霍乱沙门菌OMVs的相关研究非常关键。本专利运用自杀载体同源重组的方法，分别在猪霍乱沙门菌C78‑3染色体上引入ΔtolA、ΔtolB和ΔtolR突变，实验结果显示缺失株可以提高OMVs的产量，初步解决了OMVs疫苗生产应用中存在的产量低这一主要问题。本发明通过在猪霍乱沙门氏菌C78‑3中分别构建ΔtolA、ΔtolB和ΔtolR，探究这三个基因对猪霍乱沙门菌的生物学功能、OMVs产量的影响，推进猪霍乱沙门氏菌OMVs疫苗的开发，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。

主权项：1.一种提高OMVs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征是，包括以下步骤：1）、构建缺失tolA、tolB和tolR基因的猪霍乱沙门菌自杀载体，将野生株猪霍乱沙门菌C78-3为母本菌株与含有缺失tolA、tolB和tolR基因的猪霍乱沙门菌自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生株猪霍乱沙门菌C78-3中分别引入ΔtolA、ΔtolB和ΔtolR突变，构建出含ΔtolA、ΔtolB、ΔtolR突变的三株猪霍乱沙门菌缺失株；完成提高OMVs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建；ΔtolA缺失株的构建方法为：基于同源重组的原理，根据GenBank中猪霍乱沙门菌C78-3的全基因序列，找到tolA基因及其上下游序列，经tolA-A和tolA-B扩增获得目的基因上游同源臂tolA-L，经tolA-C和tolA-D扩增获得目的基因下游同源臂tolA-R；然后以tolA-L、tolA-R基因片段为模板进行融合PCR，扩增缺失了目的基因的tolA-LR片段，随后将tolA-LR克隆到自杀载体pRE112，即pRE112::CmR-tolA-LR；接着转化至2,6-二氨基庚二酸DAP缺陷菌株χ7213中，PCR显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pRE112::CmR-tolA-LR构建成功，酶切和序列鉴定正确后冻存；ΔtolB缺失株的构建方法为：基于同源重组的原理，根据GenBank中猪霍乱沙门菌C78-3的全基因序列，找到tolB基因及其上下游序列，经tolB-A和tolB-B扩增获得目的基因上游同源臂tolB-L，经tolB-C和tolB-D扩增获得目的基因下游同源臂tolB-R；然后以tolB-L、tolB-R基因片段为模板进行融合PCR，扩增缺失了目的基因的tolB-LR片段，随后将tolB-LR克隆到自杀载体pRE112，即pRE112::CmR-tolB-LR，接着转化至2,6-二氨基庚二酸DAP缺陷菌株χ7213中，PCR显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pRE112::CmR-tolB-LR构建成功，酶切和序列鉴定正确后冻存；ΔtolR缺失株的构建的构建方法为：基于同源重组的原理，根据GenBank中猪霍乱沙门菌C78-3的全基因序列，找到tolR基因及其上下游序列，经tolR-A和tolR-B扩增获得目的基因上游同源臂tolR-L，经tolR-C和tolR-D扩增获得目的基因下游同源臂tolR-R；然后以tolR-L、tolR-R基因片段为模板进行融合PCR，扩增634bp缺失了目的基因的tolR-LR片段，随后将tolR-LR克隆到自杀载体pRE112，即pRE112::CmR-tolR-LR，接着转化至2,6-二氨基庚二酸DAP缺陷菌株χ7213中，PCR显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pRE112::CmR-tolR-LR构建成功；酶切和序列鉴定正确后冻存。

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