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申请/专利权人：优睿赛思(武汉)生物科技有限公司

摘要：本申请公开了Claudin6‑mCherry报告基因CHO‑K1稳转细胞株制备及应用，将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签，构建成包含Claudin6‑mCherry融合基因的重组质粒；将重组质粒构建到三代慢病毒表达质粒中包装慢病毒；并转染CHO‑K1细胞；使用流式分选CHO‑K1细胞，并对其扩增培养、功能验证等步骤，获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO‑K1单克隆细胞株。

主权项：1.一种Claudin6-mCherry报告基因的CHO-K1稳转细胞株的制备方法，所述制备方法包括：构建Claudin6-mCherry慢病毒载体，所述Claudin6-mCherry慢病毒载体携带于CHO-K1细胞内稳定表达编码如SEQIDNO.2所示的融合蛋白的融合基因，所述融合基因如SEQIDNO:1所示，所述融合基因包括Claudin6基因、mCherry基因、HIS标签序列以及连接Claudin6基因和mCherry基因的linker；使用所述Claudin6-mCherry慢病毒载体稳定转染CHO-K1细胞，获得稳定表达所述融合蛋白的CHO-K1细胞；使用流式分选CHO-K1细胞并进行扩增培养、功能验证，最终获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO-K1单克隆细胞株；所述Claudin6-mCherry慢病毒载体的包装方法包括以下步骤：将三种包装质粒pL1、pL2、pL3和重组表达质粒按照2:1:1:2的质量比进行混合，获得混合质粒；其中，所述重组表达质粒携带所述融合基因，所述重组表达质粒为一穿梭质粒，所述重组表达质粒全长DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；将混合质粒用无血清培养基溶解，将混有PEI的溶液逐滴加入到混合质粒的溶液中，获得混合液；将上述混合液加入到融合度达到60％～70％的293T细胞液中，于37℃含5％二氧化碳培养箱培养，6～8小时后换液，换成含血清的培养基，48h时收集上清；将上清液进行4000rpm离心30min，去除细胞沉淀，获得所述慢病毒载体，分装保存。

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