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申请/专利权人：安徽大千生物工程有限公司

摘要：本发明提供了一种高灵敏度和特异度的sdLDL‑C比色法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1：MOPS缓冲液、PEG6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、过氧化氢酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、TOOS、表面活性剂I，其溶剂为纯化水；试剂R2：MOPS缓冲液、PEG6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、4‑AAP、过氧化物酶、mPEG‑PlD、表面活性剂II，其溶剂为纯化水。本发明还提供了一种高灵敏度和特异度的sdLDL‑C比色法检测试剂盒的制备使用方法。本发明试剂盒可用于全自动生化分析仪分析，不仅操作方便，便于临床应用，还具有较高的特异度与灵敏度。

主权项：1.一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分；所述试剂R1包括的成分及相应含量为：MOPS缓冲液20~80mM，PEG6000100~200gL，BSA20~30gL，NaCl1.8~18gL，NaN30.2~0.8gL，EDTA0.1~1gL，过氧化氢酶500~900UL，胆固醇酯酶200~800UL，胆固醇氧化酶100~1000UL，TOOS10~15mM，表面活性剂I0.05~0.1%，其溶剂为纯化水；所述试剂R2包括的成分及相应含量为：MOPS缓冲液20~80mM，PEG6000100~200gL，BSA20~30gL，NaCl1.8~18gL，NaN30.2~0.8gL，EDTA0.1~1gL，4-AAP0.5~2mM，过氧化物酶10~20UL，mPEG-PlD5~15mgL，表面活性剂II0.05~0.8%，其溶剂为纯化水；其中，所述试剂R1中的表面活性剂I由日光公司产品NIKKOLBT-9和NIKKOLBT-12中的一种或几种构成；所述试剂R2中的表面活性剂II由西宝公司产品Brij-35和DTAC中的一种或几种构成；同时，所述mPEG-PlD的获取方法如下：①重组磷脂酶D的制备：a.于GENBANK获取磷脂酶D全部CDS，于首尾分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点，即得目标序列，具体如SEQIDNO.1所示；b.得到目标序列后，送基因公司合成；c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；②重组磷脂酶D的mPEG化：a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO310g、分子筛5A5g及mPEG-500050g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；b.离心去除Na2CO3、分子筛5A悬浮物，用600mL的乙醚沉淀，再用400mL的无水苯溶解沉淀；如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组磷脂酶D，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液，于摇床室温反应3~6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-PlD。

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