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摘要：本文公开了新型显色缀合物，所述缀合物包含至少两个可检测部分。

主权项：1.包含组织反应性部分和至少两个发色团的多染料缀合物，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺，且其中所述至少两个发色团是不同的；其中所述醌甲基化物前体具有式II的结构： 其中R1选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基和糖基；R2是卤素；R3、R4、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；且R7是-CH2wNH-、-OCH2wNH-、-NHCOCH2wNH-、-CONHCH2wNH-、-CH2wO-、-OCH2wO-、-OCH2CH2Ow-、-NHCOCH2wO-、-CONHCH2wO-、-CONHCH2CH2Ow-、-CH2wS-、-OCH2wS-、-NHCOCH2wS-、-CONHCH2wS-、-CH2wNH-、-CONHCH2CH2OwCH2CH2NH、-COCH2CH2OwCH2CH2NH-、-CONHCH2NHCOCHCH3CH2wNH-或-NHCH2wNH-，其中w是范围为1至12的整数；其中所述酪酰胺具有由式III提供的结构： 其中每个R基团独立地选自氢或具有1至4个碳原子的低级烷基基团；并且其中所述至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3、Cy7、Cy3.5、Cy3B、Cy5.5、罗丹明800、荧光素、5,6-羧基荧光素、FITC、5,6-羧基罗丹明110、5,6-羧基罗丹明6G、5,6-羧基-X-罗丹明和罗丹明B异硫氰酸酯。

全文数据：用多染料醌甲基化物和酪酰胺缀合物的显色IHC和ISH染色的新颜色工业适用性的声明本公开在化学和诊断领域中具有工业适用性。公开背景免疫组织化学IHC是指使用对特定抗原特异性的抗体在生物样品中检测、定位和或定量抗原诸如蛋白的过程。IHC提供了精确地确定特定蛋白位于组织样品内的位置的实质性优势。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交ISH是指检测、定位和定量核酸的过程。IHC和ISH两者都可以在各种生物样品诸如组织例如，新鲜冷冻、福尔马林固定，石蜡包埋的和细胞学样品上进行。无论靶标是核酸还是抗原，靶标的识别可以使用各种标记例如显色、荧光、发光、辐射来检测。为了在临床环境中稳健地检测、定位和定量靶标，扩增识别事件是期望的，因为确信地检测低丰度的细胞标志物的能力对于诊断目的变得越来越重要。例如，响应于单一抗原检测事件，在标志物的位点处沉积数百或数千个标记物分子，通过扩增增强检测该识别事件的能力。不良事件经常伴随扩增，诸如作为增加的背景信号而显现的非特异性信号。增加的背景信号通过模糊可能与低、但临床上显著的表达相关的微弱信号而干扰临床分析。因此，尽管识别事件的扩增是期望的，但不增加背景信号的扩增方法是高度期望的。一种此方法是酪酰胺信号扩增TSA，其也被称为催化的报告子沉积CARD。美国专利号5,583,001公开了使用分析物依赖性酶活化系统检测和或定量分析物的方法，所述系统依赖于催化的报告子沉积来扩增可检测的标记信号。通过使标记的酚分子与酶反应，增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加从IHC和ISH测定获得的信号，同时不产生显著的背景信号扩增对于与酪酰胺扩增试剂相关的公开内容，参见例如，美国申请公开号20120171668，其以其整体通过引用并入。这些扩增方法的试剂正被应用于临床重要靶标，以提供先前无法实现的稳健诊断能力OPTIVIEW®扩增试剂盒,VentanaMedicalSystems,TucsonAZ,目录号760-099。TSA利用辣根过氧化物酶HRP和酪酰胺之间的反应。在H2O2存在的情况下，酪酰胺被转化为高反应性和短寿命的自由基中间体，其优先与蛋白上富含电子的氨基酸残基反应。然后，可以通过各种显色显现技术和或通过荧光显微术检测共价结合的可检测标记物。在高度重视空间和形态背景的固相免疫测定诸如IHC和ISH中，自由基中间体的短寿命导致酪酰胺与生成位点紧密靠近的组织上的蛋白的共价结合，给出离散和特异性的信号。具有2015年2月20日的国际申请日的标题为“QuinoneMethideAnalogSignalAmplification”的共同未决申请PCTEP20150533556描述了一种替代技术“QMSA”，其与TSA一样，可用于增加信号扩增而不增加背景信号。实际上，PCTEP20150533556描述了新型醌甲基化物类似物前体和使用醌甲基化物类似物前体检测生物样品中的一种或多种靶标的方法。其中，检测方法被描述为包括使样品与检测探针接触、然后使样品与包含酶的标记缀合物接触的步骤。该酶与包含可检测标记物的醌甲基化物类似物前体相互作用，形成反应性醌甲基化物类似物，其靠近靶标或直接在靶标上结合生物样品。然后检测可检测标记物。公开简述在本公开的一个方面是包含组织反应性部分和至少两个发色团的多染料缀合物，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺或其衍生物，且其中所述至少两个发色团允许多染料缀合物显示或产生与至少两个色原中单独的任一者都不同的颜色或信号。在一些实施方案中，所述至少两个发色团选自但不限于罗丹明800、TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3、Cy7、Cy3.5、CyB、Cy5.5和荧光素。在一些实施方案中，多染料缀合物显示与至少两个发色团中的任一个的颜色或信号不同的颜色或信号。在一些实施方案中，所述至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。在一些实施方案中，所述多官能接头是异双官能接头。在一些实施方案中，所述异双官能接头是赖氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述多官能接头是树枝状分子。在一些实施方案中，所述树枝状分子选自聚酰胺-胺PAMAM树枝状分子、Janus树枝状分子和双-MPA树枝状分子。在一些实施方案中，所述多官能接头选自降亚精胺norspermidine和精胺。在一些实施方案中，所述多官能接头包含约50gmol和约300gmol之间的分子量。在一些实施方案中，所述至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。在本公开的另一个方面是具有式I的多染料缀合物，其中“TRM”是组织反应性部分例如，醌甲基化物前体、酪酰胺或酪酰胺衍生物，诸如本文进一步公开；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是可检测部分例如色原；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；条件是所述多染料缀合物包含至少两个A基团例如两个色原。在一些实施方案中，TRM具有式II的结构：其中R1选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基和糖基；R2是卤素；R3、R4、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；且R7是-CH2wNH-、-OCH2wNH-、-NHCOCH2wNH-、-CONHCH2wNH-、-CH2wO-、-OCH2wO-、-OCH2CH2Ow-、-NHCOCH2wO-、-CONHCH2wO-、-CONHCH2CH2Ow-、-CH2wS-、-OCH2wS-、-NHCOCH2wS-、-CONHCH2wS-、-CH2wNH-、-CONHCH2CH2OwCH2CH2NH、-COCH2CH2OwCH2CH2NH-、-CONHCH2NHCOCHCH3CH2wNH-，或-NHCH2wNH-，其中w是范围为1至12的整数。在一些实施方案中，TRM具有式IIc的结构：其中，w范围为1至12。在一些实施方案中，w范围为2至6。在一些实施方案中，TRM是酪酰胺或酪酰胺衍生物。在一些实施方案中，Q具有式IVa的结构其中，f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-NRcRd；Rc和Rd独立地选自CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，Q具有式IVb的结构：其中，f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Rc和Rd独立地是CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，Z具有式Va的结构：其中，R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；R14是键、羰基、亚胺或硫酮；V是键、-CR15R16-、-O-、-S-、-NR16-、-NX-；-CR15X；-CX2-，或-CR15NR16X；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至6。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至4。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h是4。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，且h范围为2至4。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；且h范围为2至4。在一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；X是-[Qd-[A]n]e，d、n和e各自为1，且h范围为2至4。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：其中A是可检测部分。在一些实施方案中，每个A基团包含不同的可检测部分。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：其中A是可检测部分。在一些实施方案中，每个A基团包含不同的可检测部分。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：其中A是可检测部分。在一些实施方案中，每个A基团包含不同的可检测部分。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：其中A是可检测部分。在一些实施方案中，每个A基团包含不同的可检测部分。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：其中A是可检测部分。在一些实施方案中，每个A基团包含不同的可检测部分。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在一些实施方案中，所述多染料缀合物具有以下结构：。在本公开的另一个方面是检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；和使所述生物样品与第一多染料缀合物接触，所述第一多染料缀合物包含缀合至至少两个色原的组织反应性部分，其中所述第一酶将所述第一多染料缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品。在一些实施方案中，所述第一检测探针是第一一抗，且所述第一标记缀合物包含缀合至第一酶的抗物种抗体。在一些实施方案中，所述第一检测探针包含缀合至可检测标记物的第一核酸探针，且其中所述第一标记缀合物包含缀合至第一抗体的抗标记物抗体。在一些实施方案中，第一酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、神经氨酸酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。在一些实施方案中，所述第一多染料缀合物包含醌甲基化物前体部分，且其中所述第一酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，所述第一多染料缀合物包含酪酰胺或酪酰胺衍生物部分，且其中所述第一酶是辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，所述第一多染料缀合物的至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3、罗丹明800和荧光素。在一些实施方案中，至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。在一些实施方案中，所述多官能接头是赖氨酸。在一些实施方案中，所述多官能接头是树枝状分子。在一些实施方案中，所述第一多染料缀合物的至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和使所述生物样品与第二多染料缀合物接触，所述第二多染料缀合物包含缀合至至少两个色原的组织反应性部分，其中所述第二酶将所述第二多染料缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，其中所述第一多染料缀合物显示的颜色不同于所述第二多染料缀合物显示的颜色。在一些实施方案中，所述第二多染料缀合物包含酪酰胺部分，且其中所述第一酶是辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，所述第二多染料缀合物包含醌甲基化物前体部分，且其中所述第二酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，所述第二多染料缀合物的至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3、罗丹明800和荧光素。在一些实施方案中，所述第二多染料缀合物的至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。在一些实施方案中，所述多官能接头是赖氨酸。在一些实施方案中，所述多官能接头是树枝状分子。在一些实施方案中，所述第二多染料缀合物的至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和使所述生物样品与TSA单一色原缀合物或QMSA单一色原缀合物参见例如，PCTEP20150533556，其公开内容在此以其整体通过引用并入本文接触，其中所述第二酶将TSA或QMSA单一色原缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，其中所述第一多染料缀合物显示的颜色不同于所述TSA或QMSA单一色原缀合物显示的颜色。在本公开的另一个方面是检测生物样品内的靶标的方法，其包括：i使所述生物样品与对第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；iii使所述生物样品与选自以下的第一缀合物接触：a第一多染料缀合物，所述第一多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个发色团，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺或其衍生物；b第一TSA-单一色原缀合物，和c第一QMSA-单一色原缀合物；其中所述第一酶将所述第一缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品；iv使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；v使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和vi使所述生物样品与选自以下的第二缀合物接触：a第二多染料缀合物，所述第二多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个发色团，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺或其衍生物；b第二TSA-单一色原缀合物，和c第二QMSA-单一色原缀合物；其中所述第二酶将所述第二缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品；且其中所述第一和第二缀合物显示不同颜色。在本公开的另一个方面是检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；和使所述生物样品与式I的第一多染料缀合物接触，其中，“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是可检测部分；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；条件是所述多染料缀合物包含至少两个A基团例如至少两个色原；且其中所述第一酶将所述第一多染料缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括i使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和iii使所述生物样品与式I的第二多染料缀合物接触，其中所述第一多染料缀合物显示的颜色不同于所述第二多染料缀合物显示的颜色。在一些实施方案中，Q具有式IVa的结构：其中，f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-NRcRd；Rc和Rd独立地选自CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，Q具有式IVb的结构：其中，f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Rc和Rd独立地是CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，Z具有式Va的结构：其中，R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；R14是键、羰基、亚胺或硫酮；V是键、-CR15R16-、-O-、-S-、-NR16-、-NX-；-CR15X；-CX2-或-CR15NR16X；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在本公开的另一个方面是试剂盒，其包含：i具有式I的多染料缀合物：其中，“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是可检测部分；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；其中所述多染料缀合物包含至少两个A基团；ii对靶标特异性的检测探针；和iii对第一检测探针特异性的标记缀合物。在一些实施方案中，所述检测探针是一抗。在一些实施方案中，所述检测探针是缀合至标记物的核酸探针。在一些实施方案中，所述标记缀合物是抗-抗体的抗体，且其中所述抗-抗体的抗体缀合至酶。在一些实施方案中，所述标记缀合物是抗-标记物抗体，且其中所述抗-标记物抗体缀合至酶。TSA和QMSA的一个限制是要求缀合的染料包含化学反应性官能团，酪酰胺或醌甲基化物可以与所述化学反应性官能团偶联以形成相应的TSA或QMSA单一色原缀合物。尽管存在许多具有此类化学反应性基团其允许产生具有某些颜色的TSA或QMSA单一色原缀合物的化合物，但由于缺乏具有必需反应性官能团的染料，存在其他不可得的所需颜色空间例如，绿色、红色和紫罗兰色。申请人已经发现新型显色系统，其能够用TSA和QMSA技术扩展用于显色IHC和ISH染色的可用颜色的调色板。实际上，新型显色系统是离散的化学化合物，其表现出使用单一染料缀合物例如，TSA或QMSA单一色原缀合物目前无法获得的颜色。此外，新型显色系统的使用优于通过缀合混合生成新颜色的当前方法。首先，申请人已经发现不同的染料-酪酰胺TSA单一色原缀合物和染料-醌甲基化物缀合物QMSA单一色原缀合物与其同源酶和或与组织以不同的速率反应，这可以引起染色后的颜色梯度。例如，在黄色缀合物比品红色缀合物更快反应的情况下，品红色和黄色缀合物的混合物以产生红色可以导致具有更多橙色色调的更高表达组织区域，而较低表达区域看起来更紫色。申请人已经发现，使用诸如本文所述的多染料缀合物不具有该问题，因为它是离散的分子。另外，申请人已经发现，与使用单一染料缀合物例如，TSA或QMSA单一色原缀合物的混合物相比，本公开的新的多染料缀合物提供更高的总体信号。不希望受任何特定理论束缚，据信情况就是如此，因为组织上存在有限数量的共价结合位点，并且与利用离散化合物相比，混合两种或更多种色原缀合物有效地降低总体染色浓度。例如，如果总体信号在2mM处饱和，为了通过以1:1比率混合色原缀合物生成新型颜色，则将使用1mM的每种染料。然而，通过使用1mM的在单个分子上含有两个染料的多染料缀合物，可以沉积两倍的染料，导致显著更高的总体信号。最后，申请人已经进一步发现，从制造的观点来看，以特定比例混合多种缀合物的要求产生了不同批次的材料颜色变化的可能性。使用在单个分子上含有两个染料的多染料缀合物将消除该潜在问题。本文进一步描述了这些和其他优点。附图简述本专利或申请文件含有至少一幅以颜色绘制的图。根据请求并支付必要费用后，本专利或专利申请公开的具有彩图的副本将向官方提供。图1提供了说明利用一种或多种特异性结合部分和或多染料缀合物检测一种或多种靶标的步骤的流程图。图2说明沉积在靶标上的多染料缀合物和酶之间的反应，所述多染料缀合物包含醌甲基化物前体部分的部分。图3说明沉积在靶标上的多染料缀合物和酶之间的反应，所述多染料缀合物包含酪酰胺部分的部分。图4说明用醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物染色的组织样品，其中CD8靶标被染成红色在黑白图中可见为黑色和深灰色区域。图5说明用酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物染色的组织样品，其中CD8靶标被染成紫罗兰色在黑白图中可见为深灰色斑点。图6说明用酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物染色的组织样品，其中CD8靶标被染成红色在黑白图中可见为灰色和深灰色斑点。图7说明用醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物染色的组织样品，其中Ki-67靶标被染成红色在黑白图中可见为深灰色斑点。图8说明用醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物染色的组织样品，其中Ki-67靶标被染成红色在黑白图中可见为深灰色和黑色斑点。图9说明用醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物染色的组织样品，其中染色体17靶标被染成红色在黑白图中可见为黑色斑点。图10说明两种不同色原的组合以及偶联两种不同色原后的所得颜色。图11说明两种不同色原的组合以及偶联两种不同色原后的所得颜色。图12描述不同“Cy”色原的变体。图13A-13D提供了某些双重染料缀合物的光谱。图14说明用醌甲基化物Cy5-罗丹明800双重染料染色的组织样品，其中Ki67靶标被染成绿色在黑白图中可见为浅灰色斑点。详述本文公开了新型缀合物，所述缀合物包含至少两个可检测部分。在本文中称为“多染料缀合物”。所述多染料缀合物适用于QMSA和TSA方案中。还公开了使用多染料缀合物以使得能够检测生物样品中的一种或多种靶标的方法。定义如本文所用，单数术语“一a”、“一an”和“该the”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。类似地，词语“或or”意在包括“和and”，除非上下文另有清楚指出。术语“包括”以包含的方式定义，使得“包括A或B”意味着包括A、B，或者A和B。术语“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。类似地，“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。具体地，每个术语都与“包含”的通常美国专利法定义一致地定义，并且因此被解释为开放术语，意指“至少以下”，并且还被解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的装置”意味着该装置至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意味着该方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以以特定顺序概述所述步骤和方法，但技术人员将认识到，排序的步骤和方法可以变化。如本文所用，碱性磷酸酶AP是这样的酶，其通过破坏磷酸-氧键并暂时形成中间酶-底物键而通过水解去除并转移磷酸基团有机酯。例如，AP将萘酚磷酸酯底物水解成酚类化合物和磷酸。酚类与无色重氮鎓盐色原偶联，以产生不溶性的有色偶氮染料。如本文所用，术语“抗体”，偶尔缩写为“Ab”，是指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物诸如人、山羊、兔和小鼠中的免疫应答过程中产生的类似分子和抗体片段，其特异性结合目标分子或一组高度相似的目标分子，以至基本上排除结合其他分子。抗体进一步是指至少包含特异性识别并结合抗原的表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体可以由重链和轻链构成，其各自具有可变区，称为可变重VH区和可变轻VL区。VH区和VL区共同负责结合被抗体识别的抗原。术语抗体还包括完整的免疫球蛋白及其本领域众所周知的变体和部分。如本文所用，短语“抗体缀合物”是指直接或间接缀合至一种或多种标记物的那些抗体，其中所述抗体缀合物对特定靶标是特异性的且其中所述标记物能够被直接或间接检测到，诸如用二抗抗-标记物抗体检测到。例如，抗体缀合物可以诸如通过聚合物接头和或间隔子与半抗原偶联，并且可以借助半抗原间接检测抗体缀合物。作为一个替代实例，抗体缀合物可以诸如通过聚合物接头和或间隔子与荧光团偶联，并且可以直接检测抗体缀合物。抗体缀合物进一步描述于美国公开号20140147906和美国专利号8,658,389；8,686,122；8,618,265；8,846,320；和8,445,191。作为进一步的实例，术语“抗体缀合物”包括缀合至酶、例如HRP或AP的那些抗体。如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性体液或细胞免疫的产物诸如抗体分子或T细胞受体特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖例如寡糖、脂质和激素以及大分子诸如复杂碳水化合物例如多糖、磷脂、核酸和蛋白。如本文所用，术语“生物样品”可以是获自任何活的生物体、由任何活的生物体排出或分泌的任何固体或流体样品，所述生物体包括但不限于单细胞生物体，尤其是诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，以及多细胞生物体诸如植物或动物，包括来自健康或表观健康的人类受试者或受待诊断或调查的病况或疾病诸如癌症影响的人类患者的样品。例如，生物样品可以是获得自例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、房水或玻璃体液或任何身体分泌物、渗出物、流出物例如，获得自脓肿或任何其他感染或炎症部位的流体的生物流体，或获得自关节例如，正常关节或受疾病影响的关节的流体。生物样品也可以是获得自任何器官或组织的样品包括活检或尸检样本，诸如肿瘤活检，或者可以包括细胞无论是原代细胞还是培养细胞或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物样品是核提取物。在某些实例中，样品是质量控制样品，诸如公开的细胞团块切片样品之一。在其他实例中，样品是测试样品。普通技术人员可以使用本领域已知的任何方法来制备样品。可以从用于常规筛选的受试者或从被怀疑具有病症，诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者获得样品。公开的方法的所描述的实施方案也可以应用于被称为“正常”样品的不具有遗传异常、疾病、病症等的样品。样品可以包括可以被一种或多种检测探针特异性结合的多个靶标。如本文所用，术语“发色团”是指分子或负责其颜色的分子部分。当分子吸收某些波长的可见光并透射或反射其他波长时，产生颜色。具有落在可见光谱范围内的两个不同分子轨道之间的能量差的分子可以吸收可见光，且因此被适当地表征为发色团。可以吸收入射在发色团上的可见光，因此将电子从基态分子轨道激发到激发态分子轨道。如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体中的两个或更多个分子或部分包括大分子或超分子的分子。在一些实施方案中，缀合物包括一种或多种共价连接至一个或多个其他分子部分的生物分子诸如肽、蛋白、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白。如本文所用，术语“偶联couple”或“偶联coupling”是指一个分子或原子与另一个分子或原子的接合、键合例如共价键合或连接。如本文所用，术语“可检测部分”是指可产生可检测诸如视觉、电子或以其他方式信号的分子或材料，所述信号指示样品中的标记物的存在即定性分析和或浓度即定量分析。可通过任何已知或尚未发现的机制生成可检测信号，所述机制包括光子的吸收、发射和或散射包括射频、微波频率、红外频率、可见频率和紫外频率光子。可检测部分的实例包括显色、荧光、磷光和发光分子和材料。如本文所用，“半抗原”是可以与抗体特异性组合，但除非与载体分子组合，通常基本上不能具有免疫原性的小分子。在一些实施方案中，半抗原包括但不限于吡唑类例如硝基吡唑类；硝基苯基化合物；苯并呋咱类；三萜类；脲类例如苯基脲类；硫脲类例如苯基硫脲类；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物；噁唑例如噁唑磺酰胺类；噻唑类例如噻唑磺酰胺类；香豆素和香豆素衍生物；和环木脂素类。半抗原的额外非限制性实例包括噻唑类；硝基芳基类；苯并呋喃类；三萜类；和环木脂素类。半抗原的具体实例包括二硝基苯基、生物素、洋地黄毒苷和荧光素及其任何衍生物或类似物。其他半抗原描述于美国专利号8,846,320；8,618,265；7,695,929；8,481,270；和9,017,954；其公开内容以其整体通过引用并入本文。半抗原本身可以适合于直接检测，即它们可以发出合适的信号用于检测。如本文所用，辣根过氧化物酶HRP是可以与标记的分子缀合的酶。当与适当的底物一起孵育时，其产生标记的分子的有色、荧光或发光衍生物，允许其被检测和定量。HRP在电子供体存在的情况下起作用，以首先形成酶底物复合物，且然后接着起作用以氧化电子供体。例如，HRP可以作用于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐DAB以产生可检测的颜色。HRP还可以作用于标记的酪酰胺缀合物，或酪酰胺样反应性缀合物即阿魏酸盐、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、多巴胺等，以沉积有色或荧光或无色的报告子部分用于酪酰胺信号扩增TSA。如本文所用，术语“多重”、“多重的”或“多重化”是指同时、基本上同时或依次检测样品中的多种靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和或定量多种不同的核酸例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA和多肽例如，蛋白。如本文所用，术语“一抗”是指特异性结合组织样品中的靶标蛋白抗原的抗体。一抗通常是免疫组织化学程序中使用的第一抗体。如本文所用，“醌甲基化物”是醌类似物，其中相应醌上的羰基氧之一被亚甲基基团CH2替代以形成烯烃。如本文所用，术语“二抗”在本文中是指这样的抗体，其特异性结合一抗，由此在一抗和后续试剂例如标记物、酶等，如果有的话之间形成桥。二抗通常是免疫组织化学程序中使用的第二抗体。如本文所用，术语“特异性结合部分”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是分子对，其特征在于它们与彼此结合以实质上排除与其他分子的结合例如，特异性结合对可具有比结合对的两个成员中任一个与生物样品中的其他分子的结合常数至少大10-3M、大10-4M或大10-5M的结合常数。特异性结合部分的具体实例包括特异性结合蛋白例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白诸如链霉抗生物素蛋白和蛋白A。特异性结合部分还可以包括被此类特异性结合蛋白特异性结合的分子或其部分。如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定其存在、位置和或浓度的任何分子。靶标分子的实例包括蛋白、核酸序列和半抗原，诸如共价键合至蛋白的半抗原。通常使用特异性结合分子和可检测标记的一种或多种缀合物来检测靶标分子。缀合物本公开提供了包含多个可检测部分例如色原的新型缀合物。所述多染料缀合物的多个可检测部分可以是相同或不同的。在一些实施方案中，所述多染料缀合物的至少两个可检测部分是不同的。例如，所述多染料缀合物可以包含TAMRA色原和Cy5色原。在其他实施方案中，选择所述多染料缀合物的至少两个可检测部分，使得各个可检测部分各自显示不同的信号。例如，所述多染料缀合物可以包含TAMRA色原和Dabsyl色原，其中TAMRA和Dabsyl各自显示不同的颜色。在其他实施方案中，所述多染料缀合物包含多个可检测部分，其中所述可检测部分中的至少两个是相同的，且其中至少第三可检测部分是不同的。在一些实施方案中，设计多染料缀合物，使得它们提供生成新颜色的工具，用于用酪酰胺和醌甲基化物信号扩增技术的显色IHC和ISH染色。再次，如本文所示，某些颜色空间不可用，因为适于产生那些颜色的色原不能与酪酰胺或醌甲基化物前体例如试卤灵、尼罗蓝和孔雀石绿偶联。通过偶联多种不同的有色色原，多染料缀合物能够直接提供例如红色、紫罗兰色和绿色，而不依靠混合TSA或QMSA单一色原缀合物的不同组合。因此，与简单混合染料相比，能够实现优异的结果如本文所述。产生新的独特颜色的能力基于减色混合的原理Berns,R.S.,Billmeyer,F.W.,Saltzman,M.,和Billmeyer,F.W.2000BillmeyerandSaltzman'sPrinciplesofColorTechnology,Wiley,NewYork.。简而言之，这个构思由于部分或完全吸收一些波长的光而产生新的颜色。不希望受任何特定理论束缚，据信多染料缀合物的颜色取决于在减去每种染料后仍然能够通过的光的波长。在这里利用的染料据信是“窄吸收的”，意味着它们仅吸收可见光谱的相对窄的部分，同时允许大部分光通过。使用“窄吸收”染料据信允许染料混合并形成新的独特颜色，因为一定量的光仍可通过。如果使用广泛吸收的染料，据信它们最终会减去太多的光谱，留下不容易与彼此区分的深红色、棕色和黑色。图13A-13D提供了某些双重染料缀合物的光谱，并且具体地说明与单个单一染料颜色相比的双重染料颜色。在一些实施方案中，所述多染料缀合物以“线性”构型排列。所述以“线性”构型排列意指多染料缀合物的可检测部分包含多个缀合位点，使其能够i直接或间接偶联至另一个可检测部分其自身可以允许偶联至另一个可检测部分，和ii直接或间接偶联至组织反应性部分如该术语在本文中定义。包含诸如线性排列的多染料缀合物描绘于图10中。例如，将黄色色原与青色色原和组织反应性部分连接，提供了提供绿色的多染料缀合物。同样，将黄色色原与紫色色原和组织反应性部分连接，加工出提供红色的多染料缀合物。类似地，将青色色原与紫罗兰色色原和组织反应性部分连接，提供了靛蓝色。尽管这些实施例各自说明了多个色原与组织反应性部分的串联偶联，但技术人员将理解，任何多染料缀合物可以包含多于两个色原，以提供又进一步的颜色、色调或强度。尽管图10描绘了包含两个可检测部分的实例，技术人员将理解，任何数量的可检测部分可以与彼此直接或间接偶联。在一些实施方案中，所述多染料缀合物以“分支”构型排列。所述以“分支”构型排列意指接头或包含多个缀合位点的多官能接头用于将i多个可检测部分与ii组织反应性部分直接或间接偶联，如下面的示意图中所描绘并且如图11中进一步所说明。在一些实施方案中，所述多官能接头包含至少三个用于缀合的位点。在其他实施方案中，所述多官能接头包含四个或更多个用于缀合的位点。尽管下面的示意图指示多官能接头缀合至两个色原，但任何数量的可检测部分可以缀合至组织反应性部分，条件是所述多官能接头包含足够的用于缀合的位点。在一些实施方案中，所述多官能接头提供至少三个能够直接或间接偶联至i至少两个色原和ii组织反应性部分的官能团。在一些实施方案中，所述多官能接头包含多个胺、羧基、马来酰亚胺或硫醇基团以实现缀合。在一些实施方案中，所述多官能接头选自可以被正交保护和脱保护的接头，允许技术人员一次将一个色原缀合至多官能接头，因此防止不需要的副反应或副产物。在一些实施方案中，所述多官能接头具有范围为约1gmol至约300gmol的分子量。在其他实施方案中，所述多官能接头具有范围为约20gmol至约250gmol的分子量。在一些实施方案中，所述多官能接头包含增溶基团，诸如聚乙二醇PEG基团，以增加所述多染料缀合物的水溶性。在一些实施方案中，所述多官能接头包含约2至约8个PEG基团。在其他实施方案中，所述多官能接头包含约2至约6个PEG基团。在一些实施方案中，所述多官能接头是多胺。在一些实施方案中，所述多胺包含2至20个胺基。在其他实施方案中，所述多胺包含2至10个胺基。在还有其他实施方案中，所述多胺包含2至6个胺基。多胺的实例包括降亚精胺、精胺及其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述多官能接头是异双官能接头，即包含至少两个不同反应性官能团的接头。例如，异双官能接头可以包含羧酸基团和两个胺基团。在一些实施方案中，所述多官能接头是赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在其他实施方案中，所述多官能接头是具有重复基团的聚合物，所述重复基团包含至少一个用于偶联至色原的缀合位点。在其他实施方案中，所述多官能接头是树枝状分子，所述树枝状分子包含多个分支基团，每个分支基团包含至少一个缀合位点。在一些实施方案中，合适的树枝状分子包括聚酰胺-胺PAMAM树枝状分子、Janus树枝状分子即由两个树枝状楔构成且由两种不同官能团封端的树枝状分子和双-MPA树枝状分子及其衍生物。通过实例的方式且参考图11，通过多官能接头将黄色色原和青色色原连接至组织反应性部分，提供了提供绿色的多染料缀合物。同样，通过多官能接头将黄色色原和紫色色原连接至组织反应性部分，提供了提供红色的多染料缀合物。类似地，通过多官能接头将青色色原和紫罗兰色色原连接至组织反应性部分，提供了靛蓝色。尽管上面的示意图和图11中的图示描绘了与组织反应性部分偶联的两个色原，但技术人员将理解，可以将多于两个色原偶联至任何组织反应性部分，条件是所述多官能接头包含足够的用于缀合的位点。还考虑了其他排列。在一些排列中，所述多染料缀合物是“线性”和“分支”排列的杂合物，如下面的示意图中所描绘。尽管下面的示意图指示多官能接头缀合至色原，但可以利用任何可检测部分。此外，技术人员将理解，所述多官能接头或色原可以与彼此直接或间接地偶联。还有其他排列包括“高度支化”构型，其中多个多官能接头偶联以形成分支缀合物，诸如在下面说明的方案中。在这些“高度支化”构型中，所述多官能接头可以是树枝状分子或聚合物。尽管下面的示意图指示多官能接头缀合至色原，但可以利用任何可检测部分。此外，技术人员将理解，所述多官能接头或色原可以与彼此直接或间接地偶联。在一些实施方案中，本公开的多染料缀合物具有式I的结构：其中“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是可检测部分；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；条件是式I的多染料缀合物包含至少两个A基团。如本文所用，术语“组织反应性”是指能够与酶反应的部分。因此，当包含组织反应性部分的缀合物与适当的酶反应时，多染料缀合物的组织反应性部分的部分经历结构、构象和或电子变化，由此提供适于直接或间接键合至生物样品上或在可能的程度上，在生物样品内的组织反应性物质中间体。例如，在组织反应性部分是酪酰胺或其衍生物的情况下，当酪酰胺与适当的酶例如HRP反应时，形成酪酰胺自由基物质。这种高反应性酪酰胺自由基物质能够键合至生物样品中的酪氨酸残基。以类似的方式，在所述组织反应性部分是醌甲基化物前体或其衍生物的情况下，在与适当的酶例如AP反应后，醌甲基化物前体被转化为醌甲基化物或其各自的衍生物，其据信与生物样品中的亲核试剂高度反应。本文进一步描述任何缀合物的组织反应性部分的部分的作用，其与合适的酶的相互作用，以及适于检测的固定化组织-缀合物复合物的形成。在一些实施方案中，所述组织反应性部分是醌甲基化物前体或其衍生物。在一些实施方案中，醌甲基化物前体部分具有由式II提供的结构：R1是选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基或糖基的基团；R2是卤素；R3、R4、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；且R7是-CH2wNH-、-OCH2wNH-、-NHCOCH2wNH-、-CONHCH2wNH-、-CH2wO-、-OCH2wO-、-OCH2CH2Ow-、-NHCOCH2wO-、-CONHCH2wO-、-CONHCH2CH2Ow-、-CH2wS-、-OCH2wS-、-NHCOCH2wS-、-CONHCH2wS-、-CH2wNH-、-CONHCH2CH2OwCH2CH2NH、-COCH2CH2OwCH2CH2NH-、-CONHCH2NHCOCHCH3CH2wNH-或-NHCH2wNH-，其中w是范围为1至12的整数。在其他实施方案中，所述醌甲基化物前体部分具有由式IIa提供的结构：在其他实施方案中，所述醌甲基化物前体部分具有由式IIb提供的结构：其中R7是-CH2wNH-、-OCH2wNH-、-NHCOCH2wNH-、CONHCH2wNH-、-CH2wO-、-OCH2wO-、-OCH2CH2Ow-、-NHCOCH2wO-、-CONHCH2wO-、-CONHCH2CH2Ow-、-CH2wS-、-OCH2wS-、-NHCOCH2wS-、-CONHCH2wS-、-CH2wNH-、-CONHCH2CH2OwCH2CH2NH、-COCH2CH2OwCH2CH2NH-、-CONHCH2NHCOCHCH3CH2wNH-或-NHCH2wNH-，其中w独立地是范围为1至12的整数。在一些实施方案中，R7是CONHCH2wNH，且w如上所定义。在其他实施方案中，R7是CONHCH2wNH，且w范围为2至6。在其他实施方案中，所述醌甲基化物前体部分具有由式IIc提供的结构：其中w范围为1至12。在一些实施方案中，w范围为1至8。在其他实施方案中，w范围为2至8。在还有其他实施方案中，w范围为2至6。在进一步实施方案中，w是6。在一些实施方案中，任何多染料缀合物的醌甲基化物前体部分的部分衍生自以下衍生物之一。技术人员将理解，以下衍生物是用于偶联至多官能接头、可检测部分或多染料缀合物的其他组分的合适起始材料。在一些实施方案中，所述组织反应性部分是酪酰胺或其衍生物。在一些实施方案中，所述酪酰胺具有由式III提供的结构：其中每个R基团独立地选自氢或具有1至4个碳原子的低级烷基基团。在其他实施方案中，所述酪酰胺部分具有由式IIIa提供的结构：。技术人员将理解，式III和IIIa的酪酰胺或衍生物是用于偶联至多官能接头、可检测部分或多染料缀合物的其他组分的合适起始材料。在一些实施方案中，A是色原。色原的非限制性实例包括TAMRA、Dabsyl、Dabcyl、Cy3、CyB、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、罗丹明800和荧光素。在一些实施方案中，所述色原选自具有至少一个缀合位点的显色化合物，所述缀合位点能够直接或间接诸如通过基团Q偶联至组织反应性部分、基团Z或另一色原。具有多个缀合位点的色原的非限制性实例包括TAMRA、5,6-羧基荧光素、FITC、5,6-羧基罗丹明110、5,6-羧基罗丹明6G、5,6-羧基-X-罗丹明和罗丹明B异硫氰酸酯。也可以利用在5,6-位取代的其他罗丹明和荧光素衍生物。如本文所示，Q可以是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团。在一些实施方案中，Q可以包含羰基、胺、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇基团。在一些实施方案中，Q是具有2至20个碳原子、任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子，和一个或多个选自胺、羰基、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇的末端基团的分支或未分支线性基团。在其他实施方案中，Q是具有2至20个碳原子、任选地具有一个或多个氧杂原子的分支或未分支线性基团。在还有其他实施方案中，基团Q包含旨在增加分子的水溶性的组分。在一些实施方案中，基团Q被设计为充当分隔附近多染料缀合物组分例如，以减轻相邻色原之间的空间相互作用的“间隔子”。在其他实施方案中，基团Q被设计为增加多染料缀合物的水溶性或将两个多染料缀合物组分偶联在一起。在一些实施方案中，Q具有式IVa中描绘的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-NRcRd；Rc和Rd独立地选自CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，Ra或Rb中的至少一个是H。在一些实施方案中，Ra或Rb中的至少一个是H且f是1。在一些实施方案中，Ra或Rb中的至少一个是H，f是1，且s是至少2。在一些实施方案中，Q具有式IVb中描绘的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Rc和Rd独立地是CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，f是1且s是至少2。在一些实施方案中，R8是键；f是1；s是2至10；且R9和R10如上所定义。在其他实施方案中，R8是键；f是1；s是2至6；且R9和R10如上所定义。在其他实施方案中，R8是键；f是1；s是2至4；且R9和R10两者都是胺。在一些实施方案中，Q具有式IVc中描绘的结构：其中f是0、1或2；且j是范围为1至8的整数。在一些实施方案中，f是1；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且s是至少2。在一些实施方案中，f是1且s是2。在一些实施方案中，f是1且s是3。在一些实施方案中，f是1且s是4。式IVa、IVb和IVc的基于环氧烷的Q基团在本文中通过参考二醇类、诸如乙二醇类来表示。在一些实施方案中，此类环氧烷接头的并入据信增加多染料缀合物的亲水性。本领域普通技术人员将理解，随着接头中环氧烷重复单元的数量增加，缀合物的亲水性也可增加。可用于实施本公开的某些公开实施方案的额外异双官能聚亚烷基二醇间隔子描述于受让人的共同未决申请，包括“NanoparticleConjugates,”2006年4月28日提交的美国专利申请号11413,778；“AntibodyConjugates,”2006年4月27日提交的美国申请号11413,415；和“MolecularConjugate,”2005年11月23日提交的美国临时专利申请号60739,794；所述申请全部都通过引用并入本文。在式IVa的一些实施方案中，基团CRaRb和R8形成环状脂族基团。在一些实施方案中，Q具有式IVd中描绘的结构：其中R11是N或S；R12是O、N或S；且R13是C或N；条件是当R12是N或S时，R13是C；且条件是当R13是N时，R12是C。在一些实施方案中，Q衍生自4-哌啶甲酸。如本文所示，Z可以是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团。在一些实施方案中，Z可以包含羰基、胺、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇基团。在一些实施方案中，基团Z代表本文所述的多官能接头或异双官能接头，并且如此代表的化合物被设计为允许分支或高度分支的多染料缀合物。技术人员将理解，当合在一起时，基团Q和Z允许不同间隔子、PEG基团、接头等的偶联。在一些实施方案中，Z具有式Va的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；R14是键、羰基、亚胺或硫酮；V是键、-CR15R16-、-O-、-S-、-NR16-、-NX-；-CR15X；-CX2-或-CR15NR16X；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在式Va的一些实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至6。在式Va的其他实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至4。在式Va的还有其他实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h是4。在式Va的进一步实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，且h范围为2至4。在式Va的还有进一步实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；且h范围为2至4。在式Va的甚至进一步实施方案中，g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；X是-[Qd-[A]n]e，d、n和e各自为1，且h范围为2至4。在一些实施方案中，Z具有式Vb的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在式Vb的一些实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，且h范围为2至6。在式Va的其他实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，且h范围为2至4。在式Va的还有其他实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，且h是4。在式Va的进一步实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，且h范围为2至4。在式Va的还有进一步实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；且h范围为2至4。在式Va的甚至进一步实施方案中，g是0，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；X是-[Qd–[A]n]e，d、n和e各自为1，且h范围为2至4。在一些实施方案中，Z具有式Vc的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在式Vc的一些实施方案中，g是2至4，且h是2至4。在式Vc的其他实施方案中，g是2，h是2，且R18是键。在式Vc的还有其他实施方案中，g是2，h是2，R18是键，且X是-[Qd-[A]n]e。在一些实施方案中，Z具有式Vd的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-或硫醇的基团；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。在式Vd的一些实施方案中，g是2至4，且h是2至4。在式Vd的其他实施方案中，g是2，h是2，且R18是键。根据式I的多染料缀合物的实例包括下面提供的那些，其中A是可检测部分：根据式I的多染料缀合物的具体实例如下所示：或。多染料缀合物的合成本公开的多染料缀合物可以根据本领域普通技术人员已知的任何方式合成。通常，本公开的多染料缀合物可以通过将多官能接头或间隔子偶联至可检测部分和或组织反应性部分来合成。技术人员将能够选择包含能够与彼此反应的官能团的合适的起始材料。例如，如果多官能接头包含未保护的胺，则技术人员将能够选择具有能够与胺反应的官能团例如NHS-酯的发色团。同样，如果多官能接头包含羧酸基团，则技术人员将能够选择具有能够与羧酸反应的官能团例如胺的部分。在一些实施方案中，首先将已经包含受保护的多官能接头部分的色原与醌甲基化物前体偶联，以形成醌-甲基化物前体部分-第一色原缀合物。然后使醌-甲基化物前体部分-第一色原缀合物与第二色原反应，以形成如下面的示意图中所提供的相应的多染料缀合物。在该具体实例中，所述多官能接头是赖氨酸。或者，首先使具有一个受保护的反应基团的多官能接头与适当官能色原反应，以形成第一色原-接头缀合物。然后，第一色原-接头缀合物可以与适当官能化的组织反应性部分反应，以形成组织反应性部分-第一色原-接头缀合物。然后可以将组织反应性部分-第一色原-接头缀合物脱保护，随后与适当官能化的第二色原反应，以提供如下面的示意图中所说明的多染料缀合物。在该具体实例中，所述多官能接头是受保护的赖氨酸，且所述组织反应性部分是酪酰胺。技术人员将理解，相同的反应条件可用于将替代的多官能接头与色原偶联。技术人员还将理解，醌甲基化物前体衍生物可以取代酪酰胺。在另一种替代合成方法中，将第一显色化合物与受保护的间隔子化合物诸如NH2CH2CH2NHBoc偶联，以形成色原和间隔子的缀合物。然后将色原和受保护的间隔子的缀合物脱保护并与第二色原偶联以形成第一双色原缀合物。然后使双色原缀合物与4-哌啶甲酸反应，以形成第二双色原缀合物。然后使第二双色原缀合物与适当官能化的组织反应性部分反应，以形成相应的多染料缀合物，如下面的示意图中所说明。下面的合成方法提供了将多于两个色原偶联至组织反应性部分的实例，并且作为在两个阶段中发生的汇集合成进行说明。在第一阶段中，受保护的多官能接头与适当官能化的色原反应以形成第一色原-接头缀合物如以上实例中所说明。然后，第一色原-接头缀合物可以与适当官能化的组织反应性部分反应，以形成组织反应性部分-第一色原-接头缀合物。在第二阶段中，将两个当量的相同色原或两种不同色原各一个当量偶联至多官能接头例如赖氨酸以形成双色原缀合物。然后使双色原缀合物与来自第一阶段的第一色原-接头缀合物反应，以提供包含三个色原的多染料缀合物。方法本公开还提供了使用本文公开的多染料缀合物检测生物样品内的一种或多种靶标的方法。尽管本文中某些公开的实施方案、实施例或附图可以指在IHC测定中结合使用多染料缀合物，但技术人员将理解，多染料缀合物也可以用于原位杂交ISH测定或IHC和ISH测定的任何组合中。技术人员还将理解，多染料缀合物可以用于单纯测定和多重测定两者对于IHC和ISH两者中。在本文所述的实施方案中，利用检测试剂或检测试剂盒来标记例如用酶标记生物样品中的一种或多种靶标。例如，检测试剂盒可以包括第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含特异性结合部分例如抗体缀合物，所述第二组合物包含对该第一组合物特异性的检测试剂，使得可以标记靶标。在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括多于一种用于检测不同靶标的缀合物，其中每个试剂盒还包括对试剂盒内包括的每种缀合物特异性的检测试剂。在一些实施方案中，所述检测试剂是对特定靶标诸如本文进一步列举的那些靶标特异性的特异性结合部分。在一些实施方案中，所述特异性结合部分是一抗或一抗缀合物。在一些实施方案中，所述一抗缀合至可检测标记物，诸如半抗原。在其他实施方案中，所述特异性结合部分是核酸探针，其中所述核酸探针缀合至可检测标记物，诸如半抗原。所述检测试剂还可以包括对特异性结合部分特异性且自身缀合至酶的二抗。合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β-内酰胺酶。在其他实施方案中，酶包括氧化还原酶或过氧化物酶例如HRP。所述二抗可以是抗-抗体的抗体例如对特定一抗特异性或抗-标记物抗体例如对缀合至一抗或核酸探针的特定标记物特异性。在一些实施方案中，所述二抗是抗-半抗原抗体。可以根据本领域普通技术人员已知的程序将一抗、一抗缀合物、二抗和或核酸探针引入样品中，以实现用酶标记生物样品中的一种或多种靶标，且如本文所说明。参考图1，使含有一种或多种靶标的组织样品与对第一靶标特异性的第一特异性结合部分接触，以提供第一特异性结合部分-靶标复合物步骤100。在一些实施方案中，所述第一特异性结合部分是一抗或抗体缀合物例如未修饰的抗体或缀合至可检测标记物、诸如半抗原的抗体。在其他实施方案中，所述第一特异性结合部分是缀合至可检测标记物、诸如半抗原的核酸探针即寡核苷酸探针。随后，通过第一特异性结合部分，用第一酶标记第一特异性结合部分-靶标复合物步骤110。在一些实施方案中，靶标复合物的标记可以用二抗实现，所述二抗是抗-抗体的抗体例如对一抗特异性的抗体，即抗-抗体的抗体或抗-标记物抗体例如抗-标记物抗体或抗-半抗原抗体，所述二抗缀合至酶例如HRP、AP等。然后使所述组织样品与第一多染料缀合物接触步骤120，所述第一多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个可检测部分例如至少两个色原。在所述第一酶与所述第一多染料缀合物的组织反应性部分的部分相互作用后，第一可检测多染料复合物沉积在第一靶标附近或第一靶标上。最后，检测来自所述第一可检测多染料复合物的信号例如明场显微术步骤130。可以对样品内的任何数量的靶标重复上述过程。在一些实施方案中，可以引入酶失活组合物以基本上或完全失活来自任何上游步骤的任何酶。然后，所述组织样品可以与对第二靶标特异性的第二特异性结合部分接触，以提供第二特异性结合部分靶标复合物步骤100。随后，通过第二特异性结合部分，用第二酶标记第二特异性结合部分-靶标复合物步骤110。然后使所述组织样品与第二多染料缀合物接触步骤120，所述第二多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个可检测部分例如至少两个色原。在一些实施方案中，来自所述第二多染料缀合物的至少两个可检测部分的波长之和不同于来自所述第一多染料缀合物的至少两个可检测部分的波长之和。在其他实施方案中，所述第二多染料缀合物的颜色不同于所述第一多染料缀合物的颜色。在所述第二酶与所述第二多染料缀合物的组织反应性部分的部分相互作用后，第二可检测多染料复合物沉积在第二靶标附近或第二靶标上。最后，检测来自所述第二可检测多染料复合物的信号例如明场显微术步骤130。可以重复上文指出的步骤以检测生物样品内的第三、第四或第n靶标，其中第三、第四或第n多染料缀合物各自包含不同的颜色。技术人员还将理解，尽管上文指出的步骤利用多染料缀合物，但可以互换地利用仅偶联至单个可检测部分的TSA或QMSA缀合物。例如，第一靶标可以用具有单一色原的第一TSA-缀合物或具有单一色原的第一QMSA-缀合物染色；第二靶标可以用式I的多染料缀合物染色；且第三靶标可以用具有单一色原的第二TSA-缀合物或具有单一色原的第二QMSA-缀合物染色。有利地，对于刚刚描述的方法，所述第一酶和所述第二酶是不同的酶。例如，所述第一酶可以是磷酸酶或磷酸二酯酶，且所述第二酶可以是过氧化物酶。在某些实施方案中，所述第一酶是碱性磷酸酶，且所述第二酶是辣根过氧化物酶。还有利地，所述第一酶不与所述第二多染料缀合物相互作用以形成靠近所述第一靶标的第二可检测多染料复合物，且同样地，所述第二酶不与所述第一多染料缀合物相互作用以形成靠近所述第二靶标的第一可检测多染料复合物。技术人员将理解，图1中所说明的步骤可以依次地或连续地或基本上同时地进行。例如，所述组织样品可以在步骤100与两个特异性结合部分同时接触其中每个特异性结合部分对特定靶标是特异性的；且然后每个特异性结合部分-靶标复合物在步骤110用不同的酶同时标记。在这些实施方案中，在步骤100或110使用的任一试剂可以作为试剂的“合并物”或“混合物”提供。或者，可以沉积第一特异性结合部分步骤100，随后标记该第一特异性结合部分-靶标复合物步骤110。在引入任何多染料缀合物前，步骤100和110可以连续重复任何次数。随后，然后可以使具有多种酶标记的靶标复合物的组织样品与多种多染料缀合物接触。参考图2，首先将检测探针15引入具有靶标5的组织样品以形成靶标-检测探针复合物。在一些实施方案中，所述检测探针15是一抗。随后，将标记缀合物25引入所述组织样品，所述标记缀合物25包含至少一种与其缀合的酶。在描绘的实施方案中，所述标记缀合物是二抗，其中所述二抗是缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入多染料缀合物10。在酶与多染料缀合物10相互作用后，所述多染料缀合物经历结构、构象或电子变化20以形成组织反应性中间体30。在该具体实施方案中，所述多染料缀合物包含醌甲基化物前体部分，其在与碱性磷酸酶相互作用后引起氟离去基团被逐出，产生相应的醌甲基化物中间体30。然后，所述醌甲基化物中间体30与组织附近或直接在组织上形成共价键，以形成可检测多染料复合物40。然后可以根据本领域普通技术人员已知的方法检测来自所述多染料复合物40的缀合发色团的信号。参考图3，首先将检测探针55引入具有靶标50的组织样品以形成靶标-检测探针复合物。在一些实施方案中，所述检测探针55是一抗。随后，将标记缀合物60引入所述组织样品，所述标记缀合物60包含至少一种与其缀合的酶。在描绘的实施方案中，所述标记缀合物是二抗，其中所述二抗是缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入多染料缀合物70。在酶与多染料缀合物70相互作用后，形成组织反应性中间体80。在该具体实施方案中，所述多染料缀合物70包含酪酰胺部分，其在与辣根过氧化物酶相互作用后引起自由基物质80的形成。然后，所述自由基中间体80与组织附近或直接在组织上形成共价键，以形成可检测多染料复合物90。然后可以根据本领域普通技术人员已知的方法检测来自所述多染料复合物90的缀合发色团的信号。在一些实施方案中，所述生物样品用酶失活组合物预处理以使内源性过氧化物酶活性基本上或完全失活。例如，一些细胞或组织含有内源性过氧化物酶。使用HRP缀合的抗体可以导致高的、非特异性背景染色。可以通过用如本文公开的酶失活组合物预处理样品来减少该非特异性背景。在一些实施方案中，所述样品仅用过氧化氢适当的预处理溶液的约1重量％至约3重量％预处理以降低内源性过氧化物酶活性。一旦内源性过氧化物酶活性已经减少或失活，可以添加检测试剂盒，随后失活如上文所提供的检测试剂盒中存在的酶。公开的酶失活组合物和方法也可以用作失活内源性酶过氧化物酶活性的方法。在一些实施方案中，如果样本是嵌入石蜡中的样品，则可以使用适当的脱蜡流体将样品脱蜡。在废物去除剂去除脱蜡流体后，可以连续地向样本应用任何数目的物质。所述物质可以用于预处理例如蛋白-交联，暴露核酸等，变性，杂交，洗涤例如严格洗涤，检测例如将视觉或标记分子连接至探针，扩增例如扩增蛋白，基因等，复染，盖玻片等。自动化本公开的测定和方法可以是自动化的并且可以与样本处理设备组合。所述样本处理设备可以是自动化设备，诸如由VentanaMedicalSystems,Inc.销售的BENCHMARKXT仪器和DISCOVERYXT仪器。VentanaMedicalSystems,Inc.是公开用于进行自动化分析的系统和方法的许多美国专利的受让人，包括美国专利号5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请号20030211630和20040052685，其各自以其整体通过引用并入本文。或者，可以手动处理样本。所述样本处理设备可以将固定剂应用于样本。固定剂可包括交联剂诸如醛，例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂、氧化剂例如，金属离子和络合物诸如四氧化锇和铬酸、蛋白质变性剂例如，乙酸、甲醇和乙醇、机制未知的固定剂例如氯化汞、丙酮和苦味酸、组合试剂例如卡诺固定剂、甲氧基乙酰苯胺methacarn、布安液、B5固定剂、罗斯曼氏液和让德尔氏液、微波和混合固定剂例如，排除体积固定和蒸气固定。如果样本是包埋在石蜡中的样品，则可以用样本处理设备使用适当的脱蜡流体将样品脱蜡。在废物去除剂去除脱蜡流体后，可以连续地向样本应用任何数目的物质。所述物质可以用于预处理例如，蛋白-交联，暴露核酸等，变性，杂交，洗涤例如，严格洗涤，检测如将视觉或标记分子连接至探针，扩增例如扩增蛋白，基因等，复染，盖玻片等。样本处理设备可以将宽范围的物质应用于样本。所述物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和或调理剂。所述物质可以是流体例如，气体、液体或气体液体混合物等。所述流体可以是溶剂例如极性溶剂、非极性溶剂等、溶液例如水溶液或其他类型的溶液等。试剂可以包括但不限于，染色剂、润湿剂、抗体例如单克隆抗体、多克隆抗体等、抗原回收流体例如基于水性或非水性的抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等等。探针可以是分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其附接至可检测的标记物。标记物可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光试剂、半抗原和酶。在处理样本之后，用户可以将携带样本的载片输送至成像设备。此处使用的成像设备是明场成像仪载片扫描仪。一种明场成像仪是由VentanaMedicalSystems,Inc.销售的iScanCoreo™明场扫描仪。在自动化实施方案中，成像设备是如标题为IMAGINGSYSTEMANDTECHNIQUES的国际专利申请号：PCTUS2010002772专利公开号：WO2011049608中公开或2014年2月3日提交的标题为IMAGINGSYSTEMS,CASSETTES,ANDMETHODSOFUSINGTHESAME的美国专利申请公开号20140178169中公开的数字病理学装置。国际专利申请号PCTUS2010002772和美国专利申请公开号20140178169以其整体通过引用并入。在其他实施方案中，所述成像设备包括偶联至显微镜的数字相机。复染复染是在样品已经用试剂染色以检测一种或多种靶标之后进行后处理、使得它们的结构可更容易地在显微镜下被观察到的方法。例如，在盖上盖玻片之前任选使用复染剂以使得免疫组织化学染色剂更加清晰。复染剂的颜色与初始染色剂不同。众多复染剂是众所周知的，诸如苏木精、伊红、甲基绿、亚甲蓝、姬姆萨染料、阿辛蓝和核固红。DAPI4',6-二脒基-2-苯基吲哚是可以使用的荧光染料。在一些实例中，多于一种染色剂可以混合在一起以产生复染剂。这提供了灵活性以及选择染色剂的能力。例如，可以对混合物选择具有特定属性、但还不具有不同的期望属性的第一染色剂。可向混合物中添加第二染色剂，其显示出缺少的期望属性。例如，甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝可以混合在一起以形成复染剂。检测和或成像公开的实施方案的某些方面或全部方面可以通过计算机分析和或图像分析系统而自动化且得到促进。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在某些实施方案中，光显微术用于图像分析。某些公开的实施方案涉及获取数字图像。这可通过将数字照相机与显微镜联用来完成。使用图像分析软件来分析染色样品所获得的数字图像。颜色或荧光可以以数种不同方式来测量。例如，颜色可测量为红色、蓝色和绿色值；色调、饱和度和强度值；和或使用光谱成像照相机来测量特定波长或者波长范围。也可定性和半定量评估该样品。定性评价包括评价染色强度、鉴定阳性染色的细胞和在染色中涉及的细胞内区室以及评估总体样品或者载片品质。在测试样品上进行分开的评估，且该分析可包括与已知的平均值进行比较以确定所述样品是否呈现异常状态。试剂盒在一些实施方案中是试剂盒或组合物，其包含1包含组织反应性部分和至少两个发色团的多染料缀合物，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺，且其中所述至少两个发色团是不同的；和2对特定靶标特异性的特异性结合部分。在一些实施方案中，所述特异性结合部分是对靶标特异性的一抗。在其他实施方案中，所述特异性结合部分是对靶标特异性的核酸探针。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含抗-抗体的抗体抗-物种抗体或抗-标记物抗体，其中所述抗-抗体的抗体或所述抗-标记物抗体缀合至酶，且其中所述抗-抗体的抗体或所述抗-标记物抗体对试剂盒组合物的一抗或缀合至一抗的标记物或试剂盒组合物的核酸探针是特异性的。当然，任何试剂盒可以包括其他试剂，包括缓冲剂；复染剂；酶失活组合物；脱蜡溶液等，如用于手动或自动化靶标检测所需的。所述试剂盒还可以包括用于使用试剂盒的任何组分的说明书，包括将试剂盒组分应用于组织样品以实现其中的一种或多种靶标的检测的方法。样品和靶标样品包括生物学组分且通常怀疑包括一种或者多种目标靶标分子。靶标分子可以位于细胞表面上且细胞可在混悬液或者在组织切片中。靶标分子也可在细胞内且在细胞裂解或者细胞经探针渗透之后来检测。本领域普通技术人员将认识到检测样品中靶标分子的方法将取决于使用的样品和探针的类型而改变。收集和制备样品的方法是本领域已知的。在所述方法的实施方式中且与本文公开的组合物一起使用的样品诸如组织或者其他生物样品可由普通技术人员使用本领域已知的任何方法来制备。可以从用于常规筛选的受试者或从被怀疑具有病症，诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者获得样品。公开的方法的所描述的实施方案也可以应用于被称为“正常”样品的不具有遗传异常、疾病、病症等的样品。此类正常样品可用作除了别的之外用于与其他样品比较的对照。样品可针对许多不同目的来分析。例如，样品可用于科学研究或用于诊断可疑疾病，或用作用于治疗成功、存活等的预后指标。样品可包括可由探针或报告子分子特异性结合的多种靶标。所述靶标可以是核酸序列或蛋白。当涉及靶标蛋白时，在本公开通篇应当理解的是与该蛋白相关的核酸序列也可用作为靶标。在一些实例中，所述靶标是蛋白或核酸分子，其来自病原体诸如病毒、细菌或细胞内寄生物，诸如来自病毒基因组。例如，靶标蛋白可由与疾病相关例如，与其相关、有因果关系等的靶标核酸序列产生。靶标核酸序列可在尺寸上实质性改变。非限制地，所述核酸序列可具有可变数目的核酸残基。例如，靶标核酸序列可具有至少约10个核酸残基，或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，靶标多肽可在尺寸上实质性改变。非无限制地，所述靶标多肽将包含至少一个表位，其结合肽特异性抗体或者其片段。在一些实施方案中，该多肽可包含至少两个表位，其结合肽特异性抗体或者其片段。在具体的非限制性实例中，靶标蛋白由与赘生物例如，癌症相关的靶标核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生。已经在赘生细胞中鉴定出许多染色体异常包括易位和其他重排、扩增或者缺失，特别是在癌细胞诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经学癌症等中。因此，在一些实例中，至少部分的靶标分子由在样品中至少一种细胞子集中扩增或缺失的核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生。已知致癌基因是几种人类恶性肿瘤的原因。例如，涉及位于染色体18q11.2的断裂点区的SYT基因的染色体重排在滑膜肉瘤软组织肿瘤中是常见的。可例如使用具有不同标记物的探针来鉴定t18q11.2易位：第一探针包括由从SYT基因向远端伸展的靶标核酸序列产生的FPC核酸分子，且第二探针包括由向SYT基因3'或近端伸展的靶标核酸序列产生的FPC核酸。当对应于这些靶标核酸序列例如基因组靶标核酸序列的探针用于原位杂交程序中时，在SYT基因区缺失t18q11.2的正常细胞显示出两个融合由邻近的两个标记物生成信号，反映出SYT的两个完整拷贝。具有t18q11.2的异常细胞显示出单一的融合信号。在其他实例中，选择由核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生的靶标蛋白质，所述核酸序列为在恶性细胞中缺失丢失的肿瘤抑制基因。例如，位于染色体9p21的p16区包括D9S1749、D9S1747、p16INK4A、p14ARF、D9S1748、p15INK4B和D9S1752在某些膀胱癌中缺失。涉及染色体1的短臂的远端区包括例如，SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322以及染色体19的着丝粒周围pericentromeric区例如19p13-19q13包括例如，MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1的染色体缺失是中枢神经系统的某些类型的实体瘤的特征性分子特征。提供前面提及的实例以仅用于说明的目的且不意在进行限制。与赘生转化和或生长相关的许多其他细胞遗传异常是本领域普通技术人员已知的。由核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生的靶标蛋白已经与赘生转化相关且可用于公开的方法也包括EGFR基因7p12;例如，GENBANK™登记号NC-000007，核苷酸55054219-55242525，C-MYC基因8q24.21;例如，GENBANK™登记号NC-000008，核苷酸128817498-128822856,D5S2715p15.2，脂蛋白脂肪酶LPL基因8p22;例如，GENBANK™登记号NC-000008，核苷酸19841058-19869049，RB113q14;例如，GENBANK™登记号NC-000013，核苷酸47775912-47954023，p5317p13.1;例如，GENBANK™登记号NC-000017，互补序列，核苷酸7512464-7531642,N-MYC2p24;例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸151835231-151854620,CHOP12q13;例如，GENBANK™登记号NC-000012，互补序列，核苷酸56196638-56200567,FUS16p11.2;例如，GENBANK™登记号NC-000016，核苷酸31098954-31110601,FKHR13p14;例如，GENBANK™登记号NC-000013，互补序列，核苷酸40027817-40138734，以及，例如：ALK2p23;例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸29269144-29997936,Ig重链；CCND111q13;例如，GENBANK™登记号NC-000011，核苷酸69165054.69178423，BCL218q21.3;例如，GENBANK™登记号NC-000018，互补序列，核苷酸58941559-59137593，BCL63q27;例如，GENBANK™登记号NC-000003，互补序列，核苷酸188921859-188946169，MALF1,AP11p32-p31;例如，GENBANK™登记号NC-000001，互补序列，核苷酸59019051-59022373，TOP2A17q21-q22;例如，GENBANK™登记号NC-000017，互补序列，核苷酸35798321-35827695，TMPRSS21q22.3;例如，GENBANK™登记号NC-000021，互补序列，核苷酸41758351-41801948，ERG21q22.3;例如，GENBANK™登记号NC-000021，互补序列，核苷酸38675671-38955488；ETV17p21.3;例如，GENBANK™登记号NC-000007，互补序列，核苷酸13897379-13995289，EWS22q12.2;例如，GENBANK™登记号NC-000022，核苷酸27994271-28026505；FLI111q24.1-q24.3;例如，GENBANK™登记号NC-000011，核苷酸128069199-128187521，PAX32q35-q37;例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸222772851-222871944，PAX71p36.2-p36.12;例如，GENBANK™登记号NC-000001，核苷酸18830087-18935219，PTEN10q23.3;例如，GENBANK™登记号NC-000010，核苷酸89613175-89716382，AKT219q13.1-q13.2;例如，GENBANK™登记号NC-000019，互补序列，核苷酸45431556-45483036，MYCL11p34.2;例如，GENBANK™登记号NC-000001，互补序列，核苷酸40133685-40140274，REL2p13-p12;例如，GENBANK™登记号NC-000002，核苷酸60962256-61003682和CSF1R5q33-q35;例如，GENBANK™登记号NC-000005，互补序列，核苷酸149413051-149473128。在其他实例中，靶标蛋白选自与疾病或病况相关的病毒或者其他微生物。在细胞或者组织样品中的病毒或微生物来源的靶标核酸序列例如，基因组靶标核酸序列的检出指示生物体的存在。例如，靶标肽、多肽或蛋白可选自致癌或致病性病毒、细菌或细胞内寄生物诸如恶性疟原虫Plasmodiumfalciparum和其他疟原虫属物种、利什曼原虫属种、小隐孢子虫Cryptosporidiumparvum、痢疾内变形虫Entamoebahistolytica和蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia以及弓形虫属、艾美球虫属、泰勒虫属和巴贝西虫属物种的基因组。在一些实例中，靶标蛋白由来自病毒基因组的核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生。示例性病毒和相应的基因组序列括号内为GENBANK™RefSeq登记号包括人腺病毒ANC_001460、人腺病毒BNC_004001、人腺病毒CNC_001405、人腺病毒DNC_002067、人腺病毒ENC_003266、人腺病毒FNC_001454、人星形病毒NC_001943、人BK多瘤病毒V01109；GI:60851、人博卡病毒NC_007455、人冠状病毒229ENC_002645、人冠状病毒HKU1NC_006577、人冠状病毒NL63NC_005831、人冠状病毒OC43NC_005147、人肠病毒ANC_001612、人肠病毒BNC_001472、人肠病毒CNC_001428、人肠病毒DNC_001430、人红细胞病毒V9NC_004295、人泡沫病毒NC_001736、人疱疹病毒1单纯疱疹病毒类型1NC_001806、人疱疹病毒2单纯疱疹病毒类型2NC_001798、人疱疹病毒3水痘带状疱疹病毒NC_001348、人疱疹病毒4类型1EB病毒类型1NC_007605、人疱疹病毒4类型2EB病毒类型2NC_009334、人疱疹病毒5株AD169NC_001347、人疱疹病毒5株Merlin株NC_006273、人疱疹病毒6ANC_001664、人疱疹病毒6BNC_000898、人疱疹病毒7NC_001716、人疱疹病毒8类型MNC_003409、人疱疹病毒8类型PNC_009333、人免疫缺陷病毒1NC_001802、人免疫缺陷病毒2NC_001722、人偏肺病毒NC_004148、人乳头瘤病毒-1NC_001356、人乳头瘤病毒-18NC_001357、人乳头瘤病毒-2NC_001352、人乳头瘤病毒-54NC_001676、人乳头瘤病毒-61NC_001694、人乳头瘤病毒-cand90NC_004104、人乳头瘤病毒RTRX7NC_004761、人乳头瘤病毒类型10NC_001576、人乳头瘤病毒类型101NC_008189、人乳头瘤病毒类型103NC_008188、人乳头瘤病毒类型107NC_009239、人乳头瘤病毒类型16NC_001526、人乳头瘤病毒类型24NC_001683、人乳头瘤病毒类型26NC_001583、人乳头瘤病毒类型32NC_001586、人乳头瘤病毒类型34NC_001587、人乳头瘤病毒类型4NC_001457、人乳头瘤病毒类型41NC_001354、人乳头瘤病毒类型48NC_001690、人乳头瘤病毒类型49NC_001591、人乳头瘤病毒类型5NC_001531、人乳头瘤病毒类型50NC_001691、人乳头瘤病毒类型53NC_001593、人乳头瘤病毒类型60NC_001693、人乳头瘤病毒类型63NC_001458、人乳头瘤病毒类型6bNC_001355、人乳头瘤病毒类型7NC_001595、人乳头瘤病毒类型71NC_002644、人乳头瘤病毒类型9NC_001596、人乳头瘤病毒类型92NC_004500、人乳头瘤病毒类型96NC_005134、人副流感病毒1NC_003461、人副流感病毒2NC_003443、人副流感病毒3NC_001796、人双埃可病毒NC_001897、人细小病毒4NC_007018、人细小病毒B19NC_000883、人呼吸道合胞病毒NC_001781、人鼻病毒ANC_001617、人鼻病毒BNC_001490、人泡沫反转录病毒NC_001795、人嗜T淋巴细胞病毒1NC_001436、人嗜T淋巴细胞病毒2NC_001488。在某些实例中，靶标蛋白由来自致癌病毒诸如EB病毒EBV或人乳头瘤病毒HPV，例如HPV16、HPV18的核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生。在其他实例中，由核酸序列例如基因组靶标核酸序列产生的靶标蛋白来自致病性病毒，诸如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒例如丙型肝炎病毒、冠状病毒例如SARS病毒、腺病毒、多瘤病毒、巨细胞病毒CMV或者单纯疱疹病毒HSV。实施例通过使用双重染料缀合物可得的色原的调色板据信有助于高对比度多重测定。在一些实施方案中，生成的颜色易于与彼此以及与复染剂区分。这些双重染料色原可用于多重IHC测定中，例如：PD-L1CD8、PD1CD8、CD3CD8、CD4CD8、PD-L1CD8FoxP3跨多种组织类型的免疫概况分析；TTF1和P40肺中鳞状和腺癌的分层；E-钙粘蛋白和P-120鉴定乳房中的小叶相比于导管病变；和P540s高分子量细胞角蛋白鉴定前列腺中的腺癌和正常腺体。双重染料色原可以应用于多重ISH测定中，用于鉴定基因融合、缺失和或易位经由分开或分裂信号ISH测定。实例包括肺中的ALK、ROS1、RET重排；肺中的TMPRSS2-ERG融合；和淋巴瘤中的BCL2易位。实施例1-醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物包含两个发色团，即TAMRA发色团和Dabsyl发色团。尽管单独的TAMRA产生品红色且单独的Dabsyl产生黄色，但多染料缀合物产生红色。在测定中使用醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物来染色扁桃体组织中的CD8标志物。首先将组织脱蜡并修复抗原细胞调节1,CC1,VMSI#950-124约64分钟。然后应用兔抗Ki-67抗体并孵育37℃，约16分钟。随后洗涤，然后与第二山羊多克隆抗兔,碱性磷酸酶缀合物孵育37℃；约12分钟。与AP缀合物孵育之后，将载片用盐水柠檬酸钠缓冲液SSC,VMSI#950-110洗涤。200μL0.5Mtris溶液pH10.0和100μL溶解于10mM甘氨酸缓冲液pH2.0中的100至500μM醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物的共孵育进行约32分钟。将染色的组织切片用改良的Mayer's苏木精复染37℃；约4分钟，且然后与发蓝试剂一起孵育37℃；约4分钟。然后将载片通过分级乙醇系列脱水，用二甲苯透化，并手动盖上盖片。如图4中所示，醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物将CD8靶标染成红色。本实施例的醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物包含偶联至两种色原的醌甲基化物前体部分。在这里，两种色原以线性排列提供，即TAMRA充当将Dabsyl偶联至缀合物的支架。通过以下方法形成醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物中间体的编号在方案1中说明：方案1-醌甲基化物-TAMRA-Dabsyl多染料缀合物的合成。向搅拌的N-boc-乙二胺49mg,0.46mmol和三乙胺47mg,0.46mmol于干燥CH2Cl25mL中的溶液中添加dabsyl氯化物1100mg,0.31mmol。将反应混合物在室温下搅拌2小时，此时通过HPLC显示反应完成。在减压下除去溶剂，并将所得粘性油状物与甲苯3x5mL共沸。添加TFA:CH2Cl2的1:1混合物5mL，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后在减压下除去溶剂。将所得粘性油状物与甲苯3x5mL共沸。然后，将包含中间体2的所得粘性油状物溶解于DMSO3mL中，并添加三乙胺49mg,0.46mmol。然后添加TAMRA-NHS酯179mg,0.34mmol，并将所得混合物在室温下搅拌约2小时。将反应混合物用MeOH2mL稀释，并将混合物通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经约40分钟直接纯化，以得到作为红色固体的dabsyl-TAMRA缀合物3145mg,62%产率。MSESImzM+H+，C41H42N7O6S+的计算值760.3，实测值760.1。将缀合物3145mg,0.19mmol溶解于DMSO3mL中，随后添加DMAP23mg,0.19mmol和DSC49mg,0.19mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后第二次添加DMAP23mg,0.19mmol和DSC49mg,0.19mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后第三次添加DMAP23mg,0.19mmol和DSC49mg,0.19mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后添加4-哌啶甲酸123mg,0.96mmol和三乙胺97mg,0.96mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后用MeOH2mL稀释，并通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经40分钟直接纯化，以得到作为红色固体的dabsyl-TAMRA缀合物490mg,54%产率。MSESImzM+H+，C47H51N8O7S+的计算值871.4，实测值871.2。将化合物490mg,0.10mmol溶解于DMSO3mL中，随后添加DMAP13mg,0.10mmol和DSC29mg,0.11mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后添加化合物539mg,0.11mmol和三乙胺31mg,0.31mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后用MeOH2mL稀释，并通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经40分钟直接纯化，以得到作为红色固体的dabsyl-TAMRA缀合物685mg,69%产率。MSESImzM+2H2+，C61H71FN10O11PS2+的计算值601.3，实测值601.0。实施例2-酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物包含两个发色团，即TAMRA发色团和Cy5发色团。尽管单独的TAMRA产生品红色且单独的Cy5产生青色，但多染料缀合物产生紫罗兰色。在测定中使用酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物来染色扁桃体组织中的Ki67标志物。首先将组织脱蜡并用CC1修复抗原64分钟。通过与1%H2O2溶液孵育4分钟来使内源性过氧化物酶失活。应用兔抗Ki-67抗体并孵育37℃，16分钟。随后洗涤，然后与第二山羊多克隆抗兔,辣根过氧化物酶缀合物孵育37℃；8分钟。在与HRP缀合物孵育之后，将200μL约0.1至约1mM的酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物的溶液和100µL0.1%H2O2溶液共孵育约32分钟。将染色的组织切片用改良的Mayer's苏木精复染37℃；约4分钟，且然后与发蓝试剂一起孵育37℃；约4分钟。然后将载片通过分级乙醇系列脱水，用二甲苯透化，并手动盖上盖片。如图5中所示，酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物将CD8靶标染成紫罗兰色。本实施例的酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物包含偶联至两个色原的酪酰胺部分。在这里，两个色原以“分支”排列提供，使用接头在此为赖氨酸，用于将两个色原偶联至酪酰胺部分。通过以下方法形成酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物中间体的任何编号在方案2中说明：方案2-酪酰胺-TAMRA-Cy5多染料缀合物的合成。向Na-boc-L-赖氨酸20mg,0.081mmol于DMSO3mL中的溶液中添加三甲胺25mg,0.24mmol和Cy5-NHS酯50mg,0.081mmol。将反应混合物包含中间体12在室温下搅拌1小时，随后添加DMAP10mg,0.081mmol和DSC23mg,0.089mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后添加酪酰胺17mg,0.12mmol。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后用MeOH2mL稀释，并通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经40分钟直接纯化，以得到作为深蓝色固体的化合物1337mg,65%产率。MSESImzM+，C43H59N4O5+的计算值711.5，实测值711.3。将化合物1337mg,0.052mmol溶解于TFA:CH2Cl2的4:1溶液2mL中，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。在减压下除去溶剂，并将所得深蓝色粘性油状物与甲苯3x5mL共沸。在分开的烧瓶中，将氨基-peg8-甲酸25mg,0.057mmol溶解于DMSO3mL中，随后添加三乙胺17mg,0.17mmol。然后，添加TAMRA-NHS酯30mg,0.057mmol并将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加DMAP7.0mg,0.057mmol和DSC16mg,0.063mmol，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物添加至含有N-boc-裂解的化合物13的前一烧瓶中，随后添加三乙胺17mg,0.17mmol。将所得反应混合物在室温下搅拌2小时，随后用MeOH2mL稀释，并通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经40分钟直接纯化，以得到作为紫色固体的TAMRA-Cy5缀合物14TFA盐,35mg,40%产率。MSESImzM+H2+，C90H118N8O162+的计算值783.5，实测值783.3。实施例3-酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物包含两个发色团，即TAMRA发色团和FITC发色团。尽管单独的TAMRA产生品红色且单独的FITC产生黄色，但多染料缀合物产生红色。在测定中使用酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物来染色扁桃体组织中的Ki67标志物，如实施例2中所述。首先将对Ki67特异性的一抗引入扁桃体组织样品以形成抗体-靶标复合物。然后引入二抗，即缀合至辣根过氧化物酶的抗Ki67抗体。在引入酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物后，辣根过氧化物酶将酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物转化为反应性中间体，其然后能够在标记的Ki67靶标邻近或直接在标记的Ki67靶标上结合组织。如图6中所示，酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物将CD8靶标染成红色。本实施例的酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物包含偶联至两个色原的酪酰胺部分。在这里，两个色原以“分支”排列提供，使用接头在此为赖氨酸，用于将两个色原偶联至酪酰胺部分。使用与酪酰胺TAMRA-Cy5双重染料缀合物类似的程序制备酪酰胺-TAMRA-FITC多染料缀合物，其中Cy5取代为FITC。MSESImzM+H2+，C79H93N7O20S2+的计算值745.3，实测值744.9。实施例4-醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物包含两个发色团，即Dabcyl发色团和Cy3发色团。尽管单独的Dabcyl产生黄色且单独的Cy3产生品红色，但多染料缀合物产生红色。在测定中使用醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物来染色扁桃体组织中的Ki67标志物，如实施例1中所述。首先将对Ki67特异性的一抗引入扁桃体组织样品以形成抗体-靶标复合物。然后引入二抗，即缀合至碱性磷酸酶的抗Ki67抗体。在引入醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物后，碱性磷酸酶将醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物转化为反应性中间体，其然后能够在标记的Ki-67靶标邻近或直接在标记的Ki-67靶标上结合组织。如图7中所示，醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物将Ki-67靶标染成红色。本实施例的醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物包含偶联至两个色原的醌甲基化物前体部分。在这里，两个色原以“分支”排列提供，使用接头在此为赖氨酸，用于将两个色原偶联至酪酰胺部分。通过类似于以下实施例5中所述方法的方法形成醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物。实施例5-醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物IHC醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物包含两个发色团，即TAMRA发色团和Dabcyl发色团。尽管单独的TAMRA产生品红色且单独的Dabcyl产生黄色，但多染料缀合物产生红色。在测定中使用醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物来染色扁桃体组织中的Ki67标志物，如实施例1中所述。首先将对Ki67特异性的一抗引入扁桃体组织样品以形成抗体-靶标复合物。然后引入二抗，即缀合至碱性磷酸酶的抗Ki67抗体。在引入醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物后，碱性磷酸酶将醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物转化为反应性中间体，其然后能够在标记的Ki-67靶标邻近或直接在标记的Ki-67靶标上结合组织。如图8中所示，醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物将Ki-67靶标染成红色。本实施例的醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物包含偶联至两个色原的醌甲基化物前体部分。在这里，两个色原以“分支”排列提供，使用接头在此为赖氨酸，用于将两个色原偶联至酪酰胺部分。通过以下方法形成醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物中间体的任何编号在示意图中说明：方案3-醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物的合成。向N-Fmoc-N-dabcyl-L-赖氨酸7100mg,0.16mmol于DSMO5mL中的溶液中添加DMAP20mg,0.16mmol和DSC0.18mmol,45mg。然后添加化合物862mg,0.18mmol和三乙胺49mg,0.48mmol，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，此时通过HPLC显示偶联反应完成。然后添加额外量的三乙胺3mL，并将反应混合物在室温下剧烈搅拌6小时，此时如HPLC所示Fmoc基团被切割。然后将反应混合物沉淀至剧烈搅拌的EtOAc100mL中。通过真空过滤收集所得橙色固体，并用EtOAc洗涤数次，得到作为橙色固体的化合物9双-三乙胺盐,140mg,93%产率。MSESImzM+H+，C35H48FN7O7P+的计算值728.3，实测值728.0。在分开的烧瓶中，将氨基-PEG4-甲酸40mg,0.15mmol溶解于DMSO3mL中，随后添加三甲胺46mg,0.45mmol。然后，添加TAMRA-NHS酯79mg,0.15mmol并将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加DMAP18mg,0.15mmol和DSC42mg,0.17mmol，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后添加化合物9140mg,0.15mmol和三乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌2小时，随后用MeOH2mL稀释，并通过制备型HPLCC18,40mLmin，0.05%TFA，在H2O:ACN95:5至5:95中，经40分钟直接纯化，以得到作为红色固体的dabcyl-TAMRA缀合物10mg,54%产率。MSESImzM+2H2+，C71H89FN10O16P2+的计算值694.3，实测值694.0。实施例6-醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物ISH醌甲基化物-Dabcyl-Cy3多染料缀合物包含两个发色团，即TAMRA发色团和Dabcyl发色团。尽管单独的TAMRA产生品红色且单独的Dabcyl产生黄色，但多染料缀合物产生红色。在多重ISH测定中使用醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物来染色染色体17标志物，同时银染乳房组织中的HER2基因。将组织脱蜡，随后用细胞调节2CC2,VMSI#950-123,90℃；28分钟预处理，并用蛋白酶3VMSI#780-4149,37℃；20分钟处理。将DNP标记的Her2和DIG标记的染色体17探针的混合物VMSI#780-4422应用于组织，变性80℃；20分钟并在44℃下杂交6小时。在76℃下用SSC严格洗涤三次之后，将样品与兔-抗-DNP抗体孵育37℃；20分钟，随后与HRP缀合的山羊多克隆抗兔抗体一起孵育37℃；16分钟。通过与乙酸银、氢醌和过氧化氢孵育，HRP作为银沉积物被检测。连续地，通过与小鼠抗DIG抗体孵育37℃；20分钟，随后与AP缀合的山羊多克隆抗小鼠抗体孵育37℃；24分钟，显现染色体17。用SSC洗涤之后，然后将200μLpH调节溶液0.5MTris,pH10.0和100μL在10mM甘氨酸缓冲液pH2.0中溶解至50-500µM的最终浓度的醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物共孵育37℃；32分钟。将染色的组织切片用苏木精II复染37℃；4分钟，且然后与发蓝试剂一起孵育37℃；4分钟。然后将它们用去垢剂水混合物冲洗，通过分级乙醇系列脱水，用二甲苯透化，并手动盖上盖片。在引入醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物后，碱性磷酸酶将醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物转化为反应性中间体，其然后能够在标记的染色体17靶标邻近或直接在标记的染色体17靶标上结合组织。如图9中所示，醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物将染色体17靶标染成红色。本实施例的醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物包含偶联至两个色原的醌甲基化物前体部分。在这里，两个色原以“分支”排列提供，使用接头在此为赖氨酸，用于将两个色原偶联至酪酰胺部分。根据实施例5中描述的方法形成醌甲基化物-TAMRA-Dabcyl多染料缀合物。实施例7醌甲基化物Cy5-罗丹明800双重染料缀合物的合成向Cy5酸1550mg,0.096mmol于MeCN5mL中的搅拌溶液中添加DMAP13mg,0.11mmol。在DMAP已溶解之后，添加DSC27mg,0.11mmol并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后添加Nε-Boc-L-赖氨酸47mg,0.19mmol和三乙胺49mg,0.48mmol，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后在减压下除去溶剂，并将残余物溶解于CH2Cl250mL中并用1MHCl3x50mL和盐水50mL萃取。收集有机层，经MgSO4干燥，并在减压下除去溶剂。将所得残余物16Cy5-N-boc-L-赖氨酸缀合物溶解于MeCN5mL中，随后添加DMAP13mg,0.11mmol。在DMAP已溶解之后，添加DSC27mg,0.11mmol并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后添加醌甲基化物前体17.52mg,0.14mmol和三乙胺49mg,0.48mmol，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后在减压下除去溶剂，并将残余物溶解于CH2Cl250mL中并用1MHCL3x50mL和盐水50mL萃取。收集有机层，经MgSO4干燥，并在减压下除去溶剂。将所得残余物醌甲基化物-Nε-boc-L-赖氨酸-Cy5缀合物溶解于CH2Cl25mL中，随后添加TFA1mL。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，此时在减压下除去溶剂。将所得残余物溶解于MeCN3mL中，随后添加三乙胺97mg,0.96mmol和罗丹明80048mg,0.096mmol。将所得混合物在室温下搅拌16小时，此时在减压下除去溶剂。将所得残余物溶解于MeOH5mL中，并通过反相快速色谱法SNAPC18Ultra60g，50mLmin，0.05%TFA，在H2O:MeOH4:1至0:1中，经10CV直接纯化混合物以得到作为绿色固体的QM-Cy5-罗丹明800缀合物1870mg，55%产率，来自Cy5酸。MSESImzM2+，C78H98N8O8P2+的计算值662.4，实测值662.1。方案4--醌甲基化物Cy5-罗丹明800双重染料缀合物的合成。实施例8-醌甲基化物-Rhod800-Cy5多染料缀合物IHC醌甲基化物-Cy5-Rhod800多染料缀合物包含两个发色团，即罗丹明800发色团和Cy5发色团。尽管单独的罗丹明800产生黄色且单独的Cy5产生蓝色，但多染料缀合物产生绿色。在测定中使用醌甲基化物-Rhod800-Cy5多染料缀合物来染色扁桃体组织中的Ki67标志物，如实施例1中所述。首先将对Ki67特异性的一抗引入扁桃体组织样品以形成抗体-靶标复合物。然后引入二抗，即缀合至碱性磷酸酶的抗Ki67抗体。在引入醌甲基化物-Cy5-Rhod800多染料缀合物后，碱性磷酸酶将醌甲基化物-Cy5-Rhod800多染料缀合物转化为反应性中间体，其然后能够在标记的Ki-67靶标邻近或直接在标记的Ki-67靶标上结合组织。如图14中所示，醌甲基化物-Cy5-Rhod800多染料缀合物将Ki-67靶标染成绿色。在本说明书中提及和或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以其整体通过引用并入本文。如果必要，可以修改实施方案的方面，以采用各种专利、申请和出版物的构思以提供另外的实施方案。尽管已经参考具体实施方案描述了本文的公开内容，但应当理解，这些实施方案仅仅说明本公开内容的原理和应用。因此，应当理解，可以对说明性实施方案进行许多修改，并且可以在不脱离由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围的情况下设计其他布置。

权利要求：1.包含组织反应性部分和至少两个发色团的多染料缀合物，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺，且其中所述至少两个发色团是不同的。2.权利要求1的缀合物，其中所述至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3、Cy7、Cy3.5、Cy3B、Cy5.5、罗丹明800和荧光素。3.权利要求1或2的缀合物，其中所述多染料缀合物显示与所述至少两个发色团中的任一个的颜色不同的颜色。4.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。5.权利要求4的缀合物，其中所述多官能接头是异双官能接头。6.权利要求5的缀合物，其中所述异双官能接头是赖氨酸或其衍生物。7.权利要求4的缀合物，其中所述多官能接头是树枝状分子。8.权利要求7的缀合物，其中所述树枝状分子选自聚酰胺-胺PAMAM树枝状分子、Janus树枝状分子和双-MPA树枝状分子。9.权利要求4的缀合物，其中所述多官能接头选自降亚精胺和精胺。10.权利要求4的缀合物，其中所述多官能接头具有范围为约50gmol和约300gmol之间的分子量。11.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中所述至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。12.具有式I的多染料缀合物：其中“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是色原；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；条件是所述多染料缀合物包含至少两个A基团。13.权利要求12的多染料缀合物，其中TRM具有式II的结构：其中R1选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基和糖基；R2是卤素；R3、R4、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；且R7是-CH2wNH-、-OCH2wNH-、-NHCOCH2wNH-、-CONHCH2wNH-、-CH2wO-、-OCH2wO-、-OCH2CH2Ow-、-NHCOCH2wO-、-CONHCH2wO-、-CONHCH2CH2Ow-、-CH2wS-、-OCH2wS-、-NHCOCH2wS-、-CONHCH2wS-、-CH2wNH-、-CONHCH2CH2OwCH2CH2NH、-COCH2CH2OwCH2CH2NH-、-CONHCH2NHCOCHCH3CH2wNH-或-NHCH2wNH-，其中w是范围为1至12的整数。14.权利要求12的多染料缀合物，其中TRM具有式IIc的结构：其中，w范围为1至12。15.权利要求14的多染料缀合物，其中w范围为2至6。16.权利要求12的多染料缀合物，其中TRM是酪酰胺或酪酰胺衍生物。17.权利要求12至16中任一项的多染料缀合物，其中Q具有式IVa的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-NRcRd；Rc和Rd独立地选自CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。18.权利要求12至16中任一项的多染料缀合物，其中Q具有式IVb的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Rc和Rd独立地是CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。19.权利要求12至18中任一项的多染料缀合物，其中Z具有式Va的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；R14是键、羰基、亚胺或硫酮；V是键、-CR15R16-、-O-、-S-、-NR16-、-NX-；-CR15X；-CX2-或-CR15NR16X；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。20.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至6。21.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h范围为2至4。22.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，且h是4。23.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，且h范围为2至4。24.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；且h范围为2至4。25.权利要求19的多染料缀合物，其中g是0，R14是羰基，V是-CR15NR16X，R15是H，R16是H，Ra和Rb是H，R9是键，R10是胺；X是-[Qd-[A]n]e，d、n和e各自为1，且h范围为2至4。26.权利要求12的多染料缀合物，其中所述多染料缀合物具有以下结构：。27.权利要求12的多染料缀合物，其中所述多染料缀合物具有以下结构：。28.权利要求12的多染料缀合物，其中所述多染料缀合物具有以下结构：。29.权利要求12的多染料缀合物，其中所述多染料缀合物具有以下结构：。30.权利要求12的多染料缀合物，其中所述多染料缀合物具有以下结构：。31.权利要求12的多染料缀合物，其中多染料缀合物具有以下结构：。32.权利要求12的多染料缀合物，其中多染料缀合物具有以下结构：。33.权利要求12的多染料缀合物，其中多染料缀合物具有以下结构：。34.权利要求12的多染料缀合物，其中多染料缀合物具有以下结构：。35.权利要求12的多染料缀合物，其中多染料缀合物选自：或。36.检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括：i使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；和iii使所述生物样品与第一多染料缀合物接触，所述第一多染料缀合物包含缀合至至少两个色原的组织反应性部分，其中所述第一酶将所述第一多染料缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品。37.权利要求36的方法，其中所述第一检测探针是第一一抗，且所述第一标记缀合物包含缀合至所述第一酶的抗物种抗体。38.权利要求36的方法，其中所述第一检测探针包含缀合至标记物的第一核酸探针，且其中所述第一标记缀合物包含缀合至第一抗体的抗标记物抗体。39.权利要求36至38中任一项的方法，其中所述第一酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。40.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述第一多染料缀合物包含醌甲基化物前体部分，且其中所述第一酶是碱性磷酸酶。41.权利要求36至40中任一项的方法，其中所述第一多染料缀合物的至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3和荧光素。42.权利要求41的方法，其中所述至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。43.42的方法，其中所述多官能接头是赖氨酸。44.权利要求42的方法，其中所述多官能接头是树枝状分子。45.权利要求36至44中任一项的方法，其中所述第一多染料缀合物的至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。46.权利要求36至45中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：i使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和iii使所述生物样品与第二多染料缀合物接触，所述第二多染料缀合物包含缀合至至少两个色原的组织反应性部分，其中所述第二酶将所述第二多染料缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，其中所述第一多染料缀合物显示的信号不同于所述第二多染料缀合物显示的颜色。47.权利要求46的方法，其中所述第二多染料缀合物包含酪酰胺部分，且其中所述第一酶是辣根过氧化物酶。48.权利要求46或47的方法，其中所述第二多染料缀合物的至少两个发色团选自TAMRA、Dabsyl、Cy5、Dabcyl、Cy3和荧光素。49.权利要求46至48中任一项的方法，其中所述第二多染料缀合物的至少两个发色团通过多官能接头缀合至所述组织反应性部分。50.权利要求49的方法，其中所述多官能接头是赖氨酸。51.权利要求49的方法，其中所述多官能接头是树枝状分子。52.权利要求46至48中任一项的方法，其中所述第二多染料缀合物的至少两个发色团中的第一个直接或间接缀合至所述组织反应性部分，且所述至少两个发色团中的第二个直接或间接缀合至所述第一发色团。53.权利要求36至45中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：i使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和iii使所述生物样品与TSA单一色原缀合物或QMSA单一色原缀合物接触，其中所述第二酶将TSA或QMSA单一色原缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，其中所述第一多染料缀合物显示的颜色不同于所述TSA或QMSA单一色原缀合物显示的颜色。54.权利要求36至53中任一项的方法，其中所述步骤中的一个或多个由自动化系统执行。55.检测生物样品内的靶标的方法，其包括：i使所述生物样品与对第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；iii使所述生物样品与选自以下的第一缀合物接触：a第一多染料缀合物，所述第一多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个发色团，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺；b第一TSA-单一色原缀合物，和c第一QMSA-单一色原缀合物；其中所述第一酶将所述第一缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品；iv使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；v使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；vi使所述生物样品与选自以下的第二缀合物接触：a第二多染料缀合物，所述第二多染料缀合物包含组织反应性部分和至少两个发色团，其中所述组织反应性部分选自醌甲基化物前体或酪酰胺；b第二TSA-单一色原缀合物，和c第二QMSA-单一色原缀合物；其中所述第二酶将所述第二缀合物转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品；且vii其中所述第一和第二缀合物显示不同信号。56.检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括：i使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶；和iii使所述生物样品与式I的第一多染料缀合物接触，其中“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是色原；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；且其中所述第一酶将所述第一多染料缀合物转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品。57.权利要求56的方法，其中所述方法进一步包括i使所述生物样品与对第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；ii使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶；和iii使所述生物样品与式I的第二多染料缀合物接触，其中所述第一多染料缀合物显示的颜色不同于所述第二多染料缀合物显示的颜色。58.权利要求56和57中任一项的方法，其中Q具有式IVa的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-NRcRd；Rc和Rd独立地选自CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。59.权利要求56和57中任一项的方法，其中Q具有式IVb的结构：其中f是0、1或2；R8是键、O、S或NRcRd；Rc和Rd独立地是CH3或H；R9和R10独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺或硫醇的基团；且j是范围为1至8的整数。60.权利要求56和57中任一项的方法，其中Z具有式Va的结构：其中R17和R18独立地是键或选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、-NH、-N-、硫酮或硫醇的基团；R14是键、羰基、亚胺或硫酮；V是键、-CR15R16-、-O-、-S-、-NR16-、-NX-；-CR15X；-CX2-或-CR15NR16X；X如本文所定义；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或NR15R16；R15和R16独立地是键或-CH3或H；g是0或范围为1至4的整数；h是0或范围为1至8的整数；且i是1或2。61.试剂盒，其包含：i具有式I的多染料缀合物：其中“TRM”是组织反应性部分；Q是具有2至40个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代的基团；Z是键或具有2至20个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；X是H、-[Qd-[A]n]e；-N-[Z]-[X]2；或-CH[Z]-[X]2；A是色原；d是0或1；e是范围为1至4的整数；s是0或范围为1至4的整数；且t是0或范围为1至10的整数；其中所述多染料缀合物包含至少两个A基团；ii对靶标特异性的检测探针；和iii对第一检测探针特异性的标记缀合物。62.权利要求61的试剂盒，其中所述检测探针是一抗。63.权利要求61的试剂盒，其中所述检测探针是缀合至标记物的核酸探针。64.权利要求61或62的试剂盒，其中所述标记缀合物是抗-抗体的抗体，且其中所述抗-抗体的抗体缀合至酶。65.权利要求61或63的试剂盒，其中所述标记缀合物是抗-标记物抗体，且其中所述抗-标记物抗体缀合至酶。66.权利要求61至65中任一项的试剂盒，其中所述靶标是CD8。67.权利要求61至65中任一项的试剂盒，其中所述靶标是Ki-67。68.权利要求61至65中任一项的试剂盒，其中所述靶标是染色体-17。69.缀合物，其包含酪酰胺部分、TAMRA和Cy5。70.权利要求69的缀合物，其中所述TAMRA直接或间接偶联至所述酪酰胺部分，且其中所述Cy5直接或间接偶联至所述TAMRA。71.缀合物，其包含酪酰胺部分、TAMRA和FITC。72.权利要求71的缀合物，其中所述酪酰胺部分、TAMRA和FITC通过多官能接头偶联。73.权利要求72的缀合物，其中所述多官能接头是赖氨酸或其衍生物。74.缀合物，其包含醌甲基化物前体部分、Dabcyl和Cy3。75.权利要求74的缀合物，其中所述醌甲基化物前体部分、Dabcyl和Cy3通过多官能接头偶联。76.权利要求75的缀合物，其中所述多官能接头是赖氨酸或其衍生物。77.缀合物，其包含醌甲基化物前体部分、TAMRA和Dabcyl。78.权利要求77的缀合物，其中所述醌甲基化物前体部分、TAMRA和Dabcyl通过多官能接头偶联。79.权利要求78的缀合物，其中所述多官能接头是赖氨酸或其衍生物。80.缀合物，其包含醌甲基化物前体部分、TAMRA和Dabsyl。81.权利要求80的缀合物，其中所述醌甲基化物前体部分、TAMRA和Dabsyl通过多官能接头偶联。82.权利要求81的缀合物，其中所述多官能接头是赖氨酸或其衍生物。

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