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摘要：本文提供了对样品的蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法，所述方法包括：将样品与SH2超结合体接触，从而使包含于样品的含pTyr的肽与SH2超结合体结合；将结合的含pTyr的肽从样品分离；和鉴定分离的含pTyr的肽。

主权项：1.SH2超结合体的用途，用于制备对测试样品的蛋白质激酶活性进行概述的方法的试剂，所述方法包括：将所述测试样品与SH2超结合体饱和量的SH2超结合体接触，从而使包含于所述测试样品的含pTyr的肽与所述SH2超结合体结合；将所述结合的含pTyr的肽从所述测试样品中分离；通过质谱技术鉴定所述分离的含pTyr的肽，所述质谱技术包括多重反应监测、选择性反应监测、平行反应监测技术或串联质谱MSMS技术；其中：所述SH2超结合体是亲本SH2结构域的变体SH2结构域，且包含SEQIDNO:5、7、9、11、12、或13的序列，所述SH2超结合体在pTyr结合口袋中包括基于亲本SH2结构域的一个或多个氨基酸取代，其中取代导致SH2超结合体相较于亲本SH2结构域，对pTyr残基的亲和力相对于亲本SH2结构域增加至少10倍。

全文数据：用于以变体SH2结构域对蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法相关申请的交叉援引本申请要求2016年6月10日提交的美国临时申请第62384,722号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本文。技术领域本公开涉及在样品中检测蛋白质酪氨酸磷酸化的方法，包括与免疫功能和蛋白质激酶活性相关的磷酸化，所述方法包括使用质谱技术。技术背景通过各种蛋白质激酶的蛋白质磷酸化作用在多种真核细胞过程中具有重要作用，包括代谢，细胞生长，细胞周期进展，细胞凋亡，细胞骨架结构和分化。蛋白质磷酸化对于细胞信号传导尤其重要，其中磷酸化起着控制酶活性、免疫应答、蛋白质亚细胞定位、蛋白质降解和蛋白质-蛋白质相互作用等作用。在真核细胞中，蛋白质磷酸化几乎只发生在酪氨酸Tyr、丝氨酸Ser和苏氨酸Thr残基上。在人基因组编码的大约518种蛋白质激酶中，约90种被分成Tyr激酶TK，而余下的大部分被分成SerThr激酶STK以及使Tyr和SerThr磷酸化的双特异性激酶的较小亚组Manning,G.等,“人基因组的蛋白质激酶补体Theproteinkinasecomplementofthehumangenome”,2002Science298:1912。根据定义，蛋白质激酶具有使蛋白质磷酸化的保守催化结构域，但是其还可以具有其他结构域，如蛋白质-蛋白质相互作用结构域Manning,G.等,“人基因组的蛋白质激酶补体Theproteinkinasecomplementofthehumangenome”,2002Science298:1912。蛋白质激酶活性常常需要激酶自身的磷酸化。通常，TK的激酶活性通过所谓的活化环中的一个或多个Tyr残基的磷酸化来活化。该活化环是位于激酶催化核心内的短、保守肽。在大多数TK以及多个STK或双特异性激酶例如，MAP激酶和脂质激酶例如，磷脂酰肌醇3-激酶中，活化环具有1-3个酪氨酸残基，它们属于激酶活化期间最初被磷酸化的酪氨酸Huse,M.和Kuriyan,J.“蛋白质激酶的构象可塑性Theconformationalplasticityofproteinkinases”2002,Cell109:275-282；Taylor,S.S.,等“真核蛋白质激酶作为动力学分子开关的研究Evolutionoftheeukaryoticproteinkinasesasdynamicmolecularswitches”2012Phil.Trans.R.Soc.B.367:2517-2528；Bayliss,R.,等“论有丝分裂激酶活化的细胞机制Onthemolecularmechanismsofmitotickinaseactivation”,2012OpenBiology2:120136。结构研究已经揭示，活化环的磷酸化能够使激酶底物和ATP结合Hubbard,S.R.等.,“人体胰岛素受体酪氨酸激酶结构域的晶体结构Crystalstructureofthetyrosinekinasedomainofthehumaninsulinreceptor”,1994Nature372:746-754；Lemmon,M.A.和Schlessinger,J.“通过受体酪氨酸激酶的细胞信号传导Cellsignalingbyreceptortyrosinekinases”,2010Cell141:1117-1134。此外，许多TK在活化环之外或甚至激酶结构域自身之外还具有Tyr残基。这些额外的Tyr残基的磷酸化可以正向或负向自动调节激酶结构域的活性或结合其他蛋白质上的相互作用结构域等。90种人TK中超过半数与一种或多种癌症、炎性疾病或其他疾病相关Drake等.,“Clinicaltargetingofmutatedandwild-typeproteintyrosinekinasesincancer”2014Mol.Cell.Biol.34:1722-1732；Melnikova,I.和Golden,J.,“靶向蛋白质激酶Targetingproteinkinases”2004NatureRev.DrugDiscov.3:993-994。因此，认为酪氨酸激酶是药物靶标最重要的组之一，并且现在，靶向TK的许多药物已获批准，并且更多的药物处于临床前和临床评估的各阶段Gross,S.等,“用激酶抑制剂靶向癌症Targetingcancerwithkinaseinhibitors”2015J.Clin.Invest.125:1780-1789；Patterson,H.等,“炎性和自身免疫性疾病治疗中的蛋白质激酶抑制剂Proteinkinaseinhibitorsinthetreatmentofinflammatoryandautoimmunediseases”2013Clin.Exp.Immunol.176:1-10；Vlahovic,G.和Crawford,J.,“在癌症中活化酪氨酸激酶Activationoftyrosinekinasesincancer”2003Oncologist8:531-538；CohenP.,“蛋白质激酶—21世纪主要的药物靶标？Proteinkinases–themajordrugtargetsofthetwenty-firstcentury？”2002Nat.Rev.DrugDiscov.1:309-315。激酶，特别是酪氨酸激酶，还在通过使包含在免疫受体细胞质结构域内的特定酪氨酸残基磷酸化来调节免疫功能中起重要作用。具体地，免疫信号传导通过基于免疫受体Tyr的调节基序ITRM来调节，所述基于免疫受体Tyr的调节基序ITRM包括基于免疫受体Tyr的活化基序ITAM、基于免疫受体Tyr的抑制基序ITIM和基于免疫受体Tyr的转换基序ITSMLiu,H.等,“通过蛋白质-肽双向阵列筛选揭示的一种基于广泛免疫受体磷酸化的信号传导网络Acomprehensiveimmunoreceptorphosphotyrosine-basedsignalingnetworkrevealedbyreciprocalprotein-peptidearrayscreening”2015Mol.Cell.Proteomics14:1846-1858。基于质谱MS的蛋白质组学中的进展已经使其有可能鉴定由人基因组编码的所有蛋白质中约90％。最近的蛋白质组学分析表明，表达的人蛋白质中超过34可以被磷酸化Sharma,K.等,“超深人磷酸化蛋白质组学揭示了基于tyr和serthr的信号传导不同的调节性质Ultradeephumanphosphoproteomerevealsadistinctregulatorynatureoftyrandserthr-basedsignaling”,2014CellRep.8:1583-94。鉴定磷酸化氨基酸中重要的步骤是在MS分析前富集磷蛋白或磷酸肽。固定的金属离子亲和色谱IMAC常常包括使用TiO2或Ti4+可以用于富集磷酸肽。在Sharma等中，使用TiO2珠富集来自HeLaS3细胞的磷酸肽。在鉴定的大约38,000个磷酸位点中，84.1％是pSer，15.5％是pThr，且0.4％是磷酸酪氨酸pTyr。这些相对比例与十多年前使用放射性同位素标记估计的那些相似。通过MS鉴定细胞Tyr磷酸位点可以通过用抗-pTyr抗体例如，4G10，p-Tyr-100的富集和通过用过钒酸盐pervanadate一种蛋白质磷酸酶的抑制剂预处理细胞来改善。在Sharma等中，将过钒酸盐预处理与用抗-pTyr抗体富集组合允许从HeLaS3细胞中约1,300个蛋白质中鉴定超过2,000个Tyr磷酸化的肽。通过Sharma等鉴定的Tyr磷酸位点中仅有约18％似乎是新型的。这些作者总结到，尽管SerThr磷酸化事件的覆盖似乎是非常复杂的，但是Tyr磷酸化蛋白质组还远未完成。细胞信号传导依赖于受调节的和动力学的蛋白质-蛋白质相互作用，而其常常通过模块结构域介导。一个示例是Src同源性2SH2结构域，其结合含pTyr的肽。人基因组编码约120个SH2结构域。所有已知的SH2结构域结构被确认是保守的结构域折叠。通常，SH2结构域具有这样的pTyr-结合口袋以及第二口袋或亚位点，其赋予残基C-末端对连接配体中pTyr的特异性Huang,H.等,“限定人SRC同源性2结构域的特异性空间DefiningthespecificityspaceofthehumanSRChomology2domain”2008Mol.Cell.Proteomics7:768-784。此外，SH2结构域已知结合至ITRMLiu,H.等,“通过蛋白质-肽双向阵列筛选揭示的基于全面免疫还艘体磷酸酪氨酸的信号传导网络Acomprehensiveimmunoreceptorphosphotyrosine-basedsignalingnetworkrevealedbyreciprocalprotein-peptidearrayscreening”2015Mol.Cell.Proteomics14:1846-1858。发明内容本公开涉及使用称之为超结合体Superbinder的变体SH2结构域对生物样品内的蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述。该方法提供了通过将对酪氨酸磷酸化的肽基于超结合体的富集与质谱进行组合来检测和任选地定量与细胞过程相关的酪氨酸磷酸化，包括ITRM介导的免疫信号传导和蛋白质激酶的活性。最近已经发现，SH2结构域对于具有pTyr残基的肽的亲和力可以被显著地增强。例如，通过取代pTyr-结合口袋中的1、2或3个特定残基，可以获得显著增强的亲和力Kaneko,T.等,“SH2超结合体作为细胞信号传导的拮抗剂SH2Superbindersactasantagonistsofcellsignaling”,2012Sci.Signal.5:ra68；美国专利申请号14388,592。由酪氨酸激酶Src、酪氨酸激酶Fyn和衔接子蛋白Grb2这3个人蛋白质将这些取代引入SH2结构域中类似的位置显著增强了这些结构域对含pTyr的肽的亲和力。例如，具有这类取代的变体SrcSH2结构域显示了对生理性和人工含pTyr的肽增强的亲和力表1；显示了μM单位的平衡解链常数Kd值。表1：野生型和变体SrcSH2结构域对pTyr肽组的结合亲和力相似的，在3个特定氨基酸位置具有3个特定氨基酸取代的变体FynSH2结构域如本文所述的“三突变体”或“TrM”结合含pTyr的肽，所述含pTyr的肽存在于具有9.7纳摩尔的平衡解离常数Kd的受体酪氨酸激酶EGFR的序列中。野生型FynSH2结构域以3.7微摩尔μm的Kd结合相同的肽，这表明TrMFynSH2结构域的结合约380倍更紧密。现在已经出人意料地发现，SH2超结合体对含pTyr的肽增加的亲和力足够敏感，从而允许在细胞里的磷酸化状态中检测改变包括小改变，如可能由于疾病或对药物治疗的暴露而产生的那些。通过比较不同样品之间的磷酸化状态，有可能使用本公开的方法来评估与磷酸化相关的细胞过程的不同方面，包括与疾病和治疗相关的方面，例如，疾病状态，疾病预后，疾病进展，治疗的适宜性或有效性，抗药性，激酶活性状态或免疫信号传导状态。因此，本公开首次提供了鉴定数百个Tyr磷酸位点并任选地同时在这类位点定量磷酸化发生率的方法，包括从微小量的细胞、组织、活检或其他生物样本，因此允许在生物样品内系统性概述蛋白质酪氨酸磷酸化状态。这类概述可以表示pTyr信号传导的模式以及任选地其强度，包括蛋白质激酶-和ITRM-介导的信号转导，继而其可以提供生物样品内细胞的各种状态的指示，包括免疫功能和疾病状态，如癌症。在一些实施方式中，这些方法允许检测反应基本上全部已知TK激酶活性水平的pTyr状态。例如，在一些实施方式中该方法允许鉴定并且任选地定量8990已知TK的活性。当方法包括与适当对照样品获得的概况进行比较时，在不同实施方式中的方法可以检测细胞内调节事件中可能与疾病或旨在抑制特定TK的治疗相关的改变根据本公开的方面，本文提供了对测试样品的蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法，该方法包括将测试样品与SH2超结合体接触，从而使包含于测试样品含pTyr的肽与SH2超结合体结合；从测试样品分离结合的含pTyr的肽分离；和鉴定分离的含pTyr的肽。该方法还包括对分离的含pTyr的肽进行定量。鉴定和或定量可以包括质谱技术，包括例如多重反应监测MRM、选择性反应监测SRM或平行反应监测PRM技术。SH2超结合体可以是哺乳动物SH2结构域的变体，并且可以是Src、Grb2或FynSH2结构域的变体。SH2超结合体可以是三突变型SH2变体，或者可以是四突变型SH2变体。SH2超结合体可以包含序列SEQIDNO:5、7、9、11、12、13、14或15。SH2超结合体可以包含于融合蛋白内，所述融合蛋白包含一个或多个其他SH2超结合体。可以将SH2超结合体固定于固体支持物。分离可以包括高效液相色谱技术或超高效色谱技术。样品可以获得自对象，包括人对象，并且对象可以将被诊断患有癌症，或者可以是已知患有癌症，包括例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌或白血病。例如，样品可以是血清、血浆、尿、血液、组织或组织提取物。样品可以是已经暴露于酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂。该方法可以包括鉴定对应于特定蛋白质酪氨酸激酶底物的含pTyr的肽，对应于特定蛋白质酪氨酸磷酸酶底物的含pTyr的肽，来自激酶的含pTyr的肽，包括来自蛋白质激酶活化环和来自蛋白质激酶活化环外的含pTyr的肽，包含ITIM、ITSM或ITAM的免疫受体的ITRM，和或蛋白质酪氨酸磷酸酶的调节区，包括正调节区或负调节区。激酶可以是酪氨酸激酶，丝氨酸苏氨酸激酶，双特异性激酶，MAP激酶或脂质激酶。该方法还可包括使用对照样品。因此，该方法可以包括将对照样品与SH2超结合体接触，从而使包含于对照样品的含pTyr的肽与SH2超结合体结合；将结合的含pTyr的肽从对照样品分离；鉴定分离的含pTyr的肽；并将针对测试样品获得的概况与针对对照样品获得的概况进行比较。例如，对照样品可以是：来自与测试样品相同来源、但与测试样品获取时间点不同的样品，来自与测试样品相同来源、但相较于测试样品对于药物暴露不同的样品，来自已知无疾病的来源的样品，或来自已知患有疾病或疾病涉及的来源的样品。附图说明本申请的附图仅通过示例方式说明本发明的实施方式：图1是考马斯染色的丙烯酰胺凝胶的图像，其显示了由大肠杆菌细胞裂解物纯化六聚组氨酸His6-标签标记的或His6-和GST-双标签标记的重组蛋白，即野生型人SrcSH2结构域His6GST-标签标记；SEQIDNO:10、TrM人SrcSH2超结合体His6GST-标签标记；SEQIDNO:11和四倍突变的QuadM人SrcSH2超结合体His6-标签标记；SEQIDNO:13；纯化的蛋白质的近似分子量通过标志物蛋白质的混合物以千道尔顿kDa指示。图2A是实验的流程图，所述实验确定不同摩尔量的抗-pTyr抗体4G10或4G10、PY99和P-TYR-100的抗体混合物、His6GST-标签标记的TrMSrcSH2超结合体SEQIDNO:11和His6-标签标记的QuadMSrcSH2超结合体SEQIDNO:13鉴定源自过钒酸盐处理的Jurka细胞的含pTyr的肽的相对能力；图2B是表示通过各种亲和力试剂、以各种量、在图2A所述的实验中鉴定的pTyr位点的数量。图3是表示分析来自图2A和2B中实验的数据的示意图，具体显示了，以3个不同当量的摩尔量即，0.375nmol、1.875nmol和11.25nmol，通过4种亲和力试剂方格的角，见图例中的每一种，在含pTyr的肽中侧接pTyr的氨基酸序列之间成对比较通过线连接各对中的欧几里得距离线旁边的值；线的相对厚度而非距离还指示相对欧几里得距离；图3中还描述了处于pTyrYC-末端的+1、+2、+3和+4位置的氨基酸在4种亲和力试剂指定的成对比较即对各方格参数的成对比较中的特定位置处统计学上显著不同P0.08的距离；图4是根据本公开的实施方式用于概述蛋白质酪氨酸磷酸化的方法的流程图，所述蛋白质酪氨酸磷酸化包括ITRM和蛋白质激酶活化环中的Tyr磷酸位点；图5是pTyr位点log2mz峰值强度的盒须图，其使用His6-标签标记的GST-标签标记的TrMSrcSH2超结合体SEQIDNO:11由9个人细胞系鉴定，通过位点是否是之前已知或在实验中首次鉴定新型进行分类，其中粗黑线和带有箭头的数字指示中值；图6A是描述不同功能分类中在图5的磷酸化蛋白质组学分析中经Tyr磷酸化的蛋白质的百分比的盒须图，9个细胞系的中值百分比以粗线描述；图6B是与图6A类似的图表，但是仅显示了各功能分类中pTyr磷酸化的蛋白质的单一百分比，源自未用过钒酸盐处理且用抗体P-Tyr-1000进行亲和力纯化的MKN45细胞的公开的磷酸化蛋白质组学数据；图6C是说明人细胞中明显的Tyr磷酸化典型调节标有“P”的圆圈的原理图，其中使底物磷酸化的酪氨酸激酶TK，使底物去磷酸化的蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP以及结合Tyr磷酸化的蛋白质自身的包括SH2结构域的蛋白质受到Tyr磷酸化的调节。图7A是由人基因斜体编码的PTP结构域代表性列表的压缩序列比对，已经将其分成3组胞质PTP、受体D1PTP和受体D2PTP，并且针对PTPN1中的PTP结构域比对，其中PTPN1残基数量在比对的氨基酸上提供；比对上的柱状图显示了在图5的磷酸化蛋白质组学研究中发现其中的残基如所比对的经Tyr磷酸化的PTP的数量；将pTyr位点经颜色编码，在上述研究中鉴定的32个新型pTyr位点为绿色，67个之前鉴定的pTyr位点为蓝色，也在上述研究中鉴定的56个之前鉴定的pTyr位点为灰色，而已经功能注释的pTyr位点通过红色框标记。图7B是PTPN1PTP结构域三维结构PDB代码1EEO的示意图，将主要TyrY磷酸位点指示为标记的球体，并且根据提供的红至蓝梯度，用球体的颜色指示PTP家族内Tyr残基保守型的程度；图8是针对进行图4的磷酸化蛋白质组学分析的9个细胞系各自的注释图，其列出由指定基因编码的TK中活化环pTyr位点的log2mz峰值强度值的Z-评分针对在给定细胞系中检测到的所有pTyr位点计算，它们自行组织成细胞质TKCTK和受体TKRTK家族和其各种亚家族例如，CTK_FAK、RTK_EPH等；红色阴影的程度表示正Z分数的量级；蓝色阴影的程度表示负Z分数的量级；将5个细胞系中3个TKDdr1、ErbB2、IGF-1R的结果用于预测哪种TK抑制剂将特异性地阻遏下述图11A-11C中这些细胞系中的一些的生长粗线条方框；细胞系之间针对给定TK的变异程度由图表右侧垂直的数字和柱状图表示；图9A和图9B是对4个乳腺癌细胞系MCF-7、BT-474、MDA-MD-231、SK-BR-3的蛋白质的Western印迹的图像，所述蛋白质通过SDS-PAGE解析，并且源自以抗-ErbB2抗体的免疫沉淀物IP，源自以抗-IGF-1Rβ抗体的IP，或源自全血细胞裂解物WCL；用指定的一抗对印迹进行免疫印迹IB；以kDa指示蛋白质的近似分子量MW；图10A是柱状图，显示了对于来自图6磷酸化蛋白质组学分析的9个细胞系中6个BT-474,HepG2,Jurkat,MCF-7,SK-BR-3,MDA-MB-231的指定TK来说，活化环Tyr磷酸化的mRNA丰度和强度之间的确定系数R2；图10B-10D是散点图，显示了对于来自图10A的6个细胞系黑色点来说，3个TK即ERBB2图10B、IGF1RINSR图10C和DDR1图10D的相对mRNA丰度基因表达和活化环Tyr磷酸化之间的关系；图11A是这样的线图，其显示了相对于没有药物暴露，暴露于不同浓度的小分子的4个乳腺癌细胞系MCF-7、BT-474、MDA-MD-231、SK-BR-3的增殖，所述小分子抑制特定TK，即拉帕替尼ErbB2抑制剂、GSK1838705IGF-1R抑制剂和DDR1-IN-1Ddr1抑制剂；图11B是柱状图，显示了相对于没有药物暴露，当MCF-7细胞暴露于400nMDDR-1N-1、400nM拉帕替尼或400nM这两种抑制剂时的增殖，其中*指示统计上的显著差异p0.75和ΔPTM评分≥5的组合的截止值限定。这些参数通常用于磷酸化蛋白质组学研究参见例如，Sharma等；Olsen,J.V.,等,“信号传导网络中的全局、体内和位点特异性的磷酸化动力学Global,invivo,andsite-specificphosphorylationdynamicsinsignalingnetworks”2006Cell127:635-48；Lundby,A.,等,“14个不同大鼠器官和组织的蛋白质磷酸化位点定量映射Quantitativemapsofproteinphosphorylationsitesacross14differentratorgansandtissues”,2012NatureCommunications3:876。基于摩尔量对摩尔量mole-for-mole针对pTyr结合位点中的不同而调节后；即，抗体包含2个pTyr结合位点，然而SH2结构域变体每个分子包含1个pTyr结合位点，当以1x量即，0.375nmol的pTyr结合位点或5x量即，1.875nmol的pTyr结合位点比较时，TrM和QuadMSrc结构域变体从Jurkat细胞鉴定出比4G10或抗体混合物更多的pTyr位点。在各结合实验中鉴定的pTyr位点的数量在表4中表示，并且将相同的数据在图2B中制图。表4通过不同亲和力试剂从过钒酸盐处理的Jurkat细胞鉴定的pTyr位点的数量实施例3-当TrM和QuadMSrcSH2结构域变体以较高浓度存在时，它们的序列选择性变得较不明显对实施例2中鉴定的含pTyr的肽进行分析以计算不同亲和力试剂对含pTyr的肽之间的选择性距离。通过鉴定的磷酸肽中围绕pTyr残基的氨基酸残基的分布模式测量选择性。通过相应图案的欧几里德距离测量两种亲和试剂之间的选择性距离。图3显示了4G10角#1、抗体混合物角#2、TrMSrcSH2角#3和QuadMSrcSH2角#4之间的1x量即，0.375nmol的pTyr结合位点、5x量即，1.875nmol的pTyr结合位点和30x量即11.25nmol的pTyr结合位点的选择性距离。通过亲和力试剂在各组合中鉴定的序列之间的欧几里德距离沿着连接两个亲和力试剂的线示出，而连接4个亲和力试剂的线的相对厚度不是距离还指示相对欧几里德距离。图3还描述了位于pTyrYC末端的+1、+2、+3和+4位置的氨基酸，它们在指定位置统计学上显著不同P0.08的距离。当施用相对小的量即，能力等同于0.375nmolSH2结构域时，不同的亲和力试剂展现出不同的特异性图3。在TrM和QuadMSrcSH2结构域之间和各SH2结构域和抗体制备物4G10或抗体混合物之间观测到基序选择的显著差异。然而，当施用的亲和力试剂的量增加即，增加5倍至1.875nmol或增加30倍至11.25nmol；图3时，基序选择性中的差异变得较不显著或不显著。图3指示TrM和QuadMSrcSH2的序列特异性随着结合反应中SH2结构域变体的量增加而降低。实施例4-超结合体亲和力试剂提供了迄今为止酪氨酸磷化蛋白质组最广泛的观测使用SH2超结合体作为亲和力试剂在9个常用人细胞系中确定Tyr磷酸化蛋白质组。实验的示意图在图4中示出。细胞系是HeLa子宫颈癌；Bel7402和HepG2肝癌；MDA-MB-231、BT-474、SK-BR-3和MCF-7乳腺癌；MCF-10A乳腺上皮细胞；和Jurkat细胞T细胞。所有细胞系购自ATCC除了人肝细胞瘤Bel7402细胞，其获自中国医学科学院血液所InstituteofBlood,ChineseAcademyofMedicalSciences。将HeLa、Jurkat、Bel7402、Hep-G2和MCF-7细胞在补充了10％牛血清的RPMI-1640培养基中培养。BT-474细胞在RPMI-1640中生长，所述RPMI-1640补充有15％肽牛血清、2.5gL葡萄糖和0.11gL丙酮酸钠。SK-BR-3细胞在补充有15％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基DMEM中生长。MBA-MD-231细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640中培养。MCF-10A细胞在DMEMF12达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物F-12中生长，所述DMEMF12补充有5％马血清、20ngmL表皮生长因子EGF、10μgmL胰岛素、0.5lμgmL氢化可的松和100ngmL霍乱毒素Debnath,J.等,“三维基底膜培养物中生长的MCF-10A乳腺上皮腺泡的形态发生和肿瘤形成MorphogenesisandoncogenesisofMCF-10Amammaryepithelialacinigrowninthree-dimensionalbasementmembranecultures”,2003Methods30:256-268。所有的细胞在5％CO2潮湿气氛下在37℃培养，并且所有的培养基补充有100UmL的链霉素和盘尼西林。为了使pTyr鉴定最大化，对各细胞系进行过钒酸钠处理如实施例2，并且对来自各细胞系的10mg蛋白质进行胰蛋白酶消化，并且后续通过37.5nmol1.5mg的His6GST-标签标记的TrMSrcSH2SEQIDNO:11和Ti4+-IMAC富集。纯化来自各细胞系的含pTyr的肽如实施例2中所述。洗脱的肽通过运行24小时的SCX-RPLC-MSMS分析而鉴定。如之前Wang,F.,等,“具有在线样品加载、同位素二甲基标记和多维度分离用于高通量定量蛋白质组分析的全自动系统Afullyautomatedsystemwithonlinesampleloading,isotopedimethyllabelingandmultidimensionalseparationforhigh-throughputquantitativeproteomeanalysis”,2010Anal.Chem.82:3007–3015所述，制备14cm的RP-SCX反相强阳离子交换双相柱内径200μm。将肽再次溶解于0.1％FA中，并且自动加载到RP-SCX双相捕获柱的RP片段上。保留在RP片段上的肽通过SCX整体柱上的RP梯度洗脱。随后，使用以10、20、30、50、75、100、200、1000或10、30、50、100、1000mM乙酸铵的一系列逐步洗脱将肽从SCX整体柱洗脱到第二维度的C18分析柱。各洗脱持续10分钟，然后用0.1％FA进行10分钟平衡。最后，进行RP分离。如实施例2中所述进行MSMS分析。9个细胞系的该磷酸化蛋白质组学概述导致鉴定19,570个不同的含pTyr的肽和10,030个独特的pTyr位点表5。含pTyr的肽源自4,773个蛋白质。这似乎是迄今为止在单个研究中获得的最大数量的pTyr位点。大约36％鉴定的pTyr位点是新型的，因为它们没有列于ProteomeScout数据库版本：20151011，该数据库包含了在多个其他数据库中收集的磷酸化位点，包括PhosphoSitePlus、dbPTM和UniProtKBMatlock,M.K.,等,“ProteomeScout：翻译后修饰和蛋白质的库和分析源ProteomeScout:arepositoryandanalysisresourceforpost-translationalmodificationsandproteins.”2015NucleicAcidsRes.43:D521-30。事实上，该工作将ProteomeScout数据库扩大了约10％。本研究和之前的研究就各细胞鉴定的全部和新型pTyr位点而言的比较更加令人惊讶表5。例如，在乳腺癌细胞系SK-BR-3的单个研究中之前鉴定的pTyr位点的最大数量是158；而基于超结合体的方法在SK-BR-3中鉴定了3,187个pTyr位点，其中692个是新型的表5。因此，基于超结合体的亲和力纯化AP-MSMS方法相比之前的方法能够实现Tyr磷酸化蛋白质组更广和更深的覆盖。表5使用基于超结合体的AP-MSMS方法鉴定的pTyr位点*经由抗体P-Tyr-100CST有限公司CellSignalingTechnology,Inc或CST富集的pTyr肽；包括CST治疗组ID作为参照，除了MDA-MB-231，对应研究的PubMedID在括号中给出。实施例5-通过SH2超结合体揭示的酪氨酸磷酸化蛋白质组的分析将获自实施例4的磷酸化蛋白质组学信息进行不同的分析。9个细胞系具有显著不同的Tyr磷酸化概况。11个人细胞系的在先分析揭示大约73％鉴定的蛋白质对于所有细胞是常见的Geiger,T.等.“11个常见细胞系的比较性蛋白质组织分析揭示大多数蛋白质的泛在性但表达各异Comparativeproteomicanalysisofelevencommoncelllinesrevealsubiquitousbutvaryingexpressionofmostproteins”2012Mol.Cell.Proteomics11:M111.014050。两种或多种细胞类型之间共有的pTyr位点的数量遵循与在所有9个细胞系中检测到的仅为约5.8％58410,030的pTyr位点相似的趋势表6。此外，在该研究中鉴定的大约50％新型pTyr位点对单个细胞类型具有特异性表6。通常，pTyr位点的细胞类型特异性越高，它就越有可能成为新型的即，在该研究中第一个鉴定的，表6。表6实施例4的磷酸化蛋白质组学分析中发现的对2到9的细胞系具有细胞类型特异性或常见的pTyr位点的数量细胞特异性pTyr位点数新型pTyr位点数新型pTyr位点％13,4701,75850.7％21,66170842.6％31,12739735.2％486525429.4％573117423.8％654511020.2％75517413.4％84965410.9％9584447.5％总计10,0303,57535.6％所有9个细胞系中发现的相对高丰度的pTyr位点可以解释为什么在该组内通过超结合体鉴定的相对较少的新型位点约7.5％。也就是，当有限量的亲和力试剂用于之前的AP-MSMS分析即，使用抗-pTyr抗体作为亲和力试剂时，这些高丰度的pTyr肽可能已经被优先地分离。按照该原理，预测使用饱和量的超结合体鉴定的新型pTyr位点相对于迄今为止报道的那些将通常具有较低的丰度。与预测一致，对应已知pTyr位点的肽的平均mz峰强度是新型pTyr位点的约2.5倍图5。新型pTyr位点的丰度显著地低于已知的P李顺成（Li,Shun-Cheng）用于以变体SH2结构域对蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法96403-4TUS62384,7222016-06-1015PatentInversion3.51536PRT智人（Homosapiens）1MetGlySerAsnLysSerLysProLysAspAlaSerGlnArgArgArg151015SerLeuGluProAlaGluAsnValHisGlyAlaGlyGlyGlyAlaPhe202530ProAlaSerGlnThrProSerLysProAlaSerAlaAspGlyHisArg354045GlyProSerAlaAlaPheAlaProAlaAlaAlaGluProLysLeuPhe505560GlyGlyPheAsnSerSerAspThrValThrSerProGlnArgAlaGly65707580ProLeuAlaGlyGlyValThrThrPheValAlaLeuTyrAspTyrGlu859095SerArgThrGluThrAspLeuSerPheLysLysGlyGluArgLeuGln100105110IleValAsnAsnThrGluGlyAspTrpTrpLeuAlaHisSerLeuSer115120125ThrGlyGlnThrGlyTyrIleProSerAsnTyrValAlaProSerAsp130135140SerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArgGlu145150155160SerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPheLeu165170175ValArgGluSerGluThrThrLysGlyAlaTyrCysLeuSerValSer180185190AspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLysIleArg195200205LysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPheAsn210215220SerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGlyLeu225230235240CysHisArgLeuThrThrValCysProThrSerLysProGlnThrGln245250255GlyLeuAlaLysAspAlaTrpGluIleProArgGluSerLeuArgLeu260265270GluValLysLeuGlyGlnGlyCysPheGlyGluValTrpMetGlyThr275280285TrpAsnGlyThrThrArgValAlaIleLysThrLeuLysProGlyThr290295300MetSerProGluAlaPheLeuGlnGluAlaGlnValMetLysLysLeu305310315320ArgHisGluLysLeuValGlnLeuTyrAlaValValSerGluGluPro325330335IleTyrIleValThrGluTyrMetSerLysGlySerLeuLeuAspPhe340345350LeuLysGlyGluThrGlyLysTyrLeuArgLeuProGlnLeuValAsp355360365MetAlaAlaGlnIleAlaSerGlyMetAlaTyrValGluArgMetAsn370375380TyrValHisArgAspLeuArgAlaAlaAsnIleLeuValGlyGluAsn385390395400LeuValCysLysValAlaAspPheGlyLeuAlaArgLeuIleGluAsp405410415AsnGluTyrThrAlaArgGlnGlyAlaLysPheProIleLysTrpThr420425430AlaProGluAlaAlaLeuTyrGlyArgPheThrIleLysSerAspVal435440445TrpSerPheGlyIleLeuLeuThrGluLeuThrThrLysGlyArgVal450455460ProTyrProGlyMetValAsnArgGluValLeuAspGlnValGluArg465470475480GlyTyrArgMetProCysProProGluCysProGluSerLeuHisAsp485490495LeuMetCysGlnCysTrpArgLysGluProGluGluArgProThrPhe500505510GluTyrLeuGlnAlaPheLeuGluAspTyrPheThrSerThrGluPro515520525GlnTyrGlnProGlyGluAsnLeu5305352217PRT智人2MetGluAlaIleAlaLysTyrAspPheLysAlaThrAlaAspAspGlu151015LeuSerPheLysArgGlyAspIleLeuLysValLeuAsnGluGluCys202530AspGlnAsnTrpTyrLysAlaGluLeuAsnGlyLysAspGlyPheIle354045ProLysAsnTyrIleGluMetLysProHisProTrpPhePheGlyLys505560IleProArgAlaLysAlaGluGluMetLeuSerLysGlnArgHisAsp65707580GlyAlaPheLeuIleArgGluSerGluSerAlaProGlyAspPheSer859095LeuSerValLysPheGlyAsnAspValGlnHisPheLysValLeuArg100105110AspGlyAlaGlyLysTyrPheLeuTrpValValLysPheAsnSerLeu115120125AsnGluLeuValAspTyrHisArgSerThrSerValSerArgAsnGln130135140GlnIlePheLeuArgAspIleGluGlnValProGlnGlnProThrTyr145150155160ValGlnAlaLeuPheAspPheAspProGlnGluAspGlyGluLeuGly165170175PheArgArgGlyAspPheIleHisValMetAspAsnSerAspProAsn180185190TrpTrpLysGlyAlaCysHisGlyGlnThrGlyMetPheProArgAsn195200205TyrValThrProValAsnArgAsnVal2102153537PRT智人3MetGlyCysValGlnCysLysAspLysGluAlaThrLysLeuThrGlu151015GluArgAspGlySerLeuAsnGlnSerSerGlyTyrArgTyrGlyThr202530AspProThrProGlnHisTyrProSerPheGlyValThrSerIlePro354045AsnTyrAsnAsnPheHisAlaAlaGlyGlyGlnGlyLeuThrValPhe505560GlyGlyValAsnSerSerSerHisThrGlyThrLeuArgThrArgGly65707580GlyThrGlyValThrLeuPheValAlaLeuTyrAspTyrGluAlaArg859095ThrGluAspAspLeuSerPheHisLysGlyGluLysPheGlnIleLeu100105110AsnSerSerGluGlyAspTrpTrpGluAlaArgSerLeuThrThrGly115120125GluThrGlyTyrIleProSerAsnTyrValAlaProValAspSerIle130135140GlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysLeuGlyArgLysAspAlaGlu145150155160ArgGlnLeuLeuSerPheGlyAsnProArgGlyThrPheLeuIleArg165170175GluSerGluThrThrLysGlyAlaTyrSerLeuSerIleArgAspTrp180185190AspAspMetLysGlyAspHisValLysHisTyrLysIleArgLysLeu195200205AspAsnGlyGlyTyrTyrIleThrThrArgAlaGlnPheGluThrLeu210215220GlnGlnLeuValGlnHisTyrSerGluArgAlaAlaGlyLeuCysCys225230235240ArgLeuValValProCysHisLysGlyMetProArgLeuThrAspLeu245250255SerValLysThrLysAspValTrpGluIleProArgGluSerLeuGln260265270LeuIleLysArgLeuGlyAsnGlyGlnPheGlyGluValTrpMetGly275280285ThrTrpAsnGlyAsnThrLysValAlaIleLysThrLeuLysProGly290295300ThrMetSerProGluSerPheLeuGluGluAlaGlnIleMetLysLys305310315320LeuLysHisAspLysLeuValGlnLeuTyrAlaValValSerGluGlu325330335ProIleTyrIleValThrGluTyrMetAsnLysGlySerLeuLeuAsp340345350PheLeuLysAspGlyGluGlyArgAlaLeuLysLeuProAsnLeuVal355360365AspMetAlaAlaGlnValAlaAlaGlyMetAlaTyrIleGluArgMet370375380AsnTyrIleHisArgAspLeuArgSerAlaAsnIleLeuValGlyAsn385390395400GlyLeuIleCysLysIleAlaAspPheGlyLeuAlaArgLeuIleGlu405410415AspAsnGluTyrThrAlaArgGlnGlyAlaLysPheProIleLysTrp420425430ThrAlaProGluAlaAlaLeuTyrGlyArgPheThrIleLysSerAsp435440445ValTrpSerPheGlyIleLeuLeuThrGluLeuValThrLysGlyArg450455460ValProTyrProGlyMetAsnAsnArgGluValLeuGluGlnValGlu465470475480ArgGlyTyrArgMetProCysProGlnAspCysProIleSerLeuHis485490495GluLeuMetIleHisCysTrpLysLysAspProGluGluArgProThr500505510PheGluTyrLeuGlnSerPheLeuGluAspTyrPheThrAlaThrGlu515520525ProGlnTyrGlnProGlyGluAsnLeu5305354109PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE野生型人SrcSH2结构域4AspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArg151015GluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPhe202530LeuValArgGluSerGluThrThrLysGlyAlaTyrCysLeuSerVal354045SerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLysIle505560ArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPhe65707580AsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGly859095LeuCysHisArgLeuThrThrValCysProThrSerLys1001055109PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURETrM人SrcSH2结构域5AspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArg151015GluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPhe202530LeuValArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerVal354045SerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLeuIle505560ArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPhe65707580AsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGly859095LeuCysHisArgLeuThrThrValCysProThrSerLys1001056104PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE野生型人Grb2SH2结构域6MetLysProHisProTrpPhePheGlyLysIleProArgAlaLysAla151015GluGluMetLeuSerLysGlnArgHisAspGlyAlaPheLeuIleArg202530GluSerGluSerAlaProGlyAspPheSerLeuSerValLysPheGly354045AsnAspValGlnHisPheLysValLeuArgAspGlyAlaGlyLysTyr505560PheLeuTrpValValLysPheAsnSerLeuAsnGluLeuValAspTyr65707580HisArgSerThrSerValSerArgAsnGlnGlnIlePheLeuArgAsp859095IleGluGlnValProGlnGlnPro1007109PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURETrM人Grb2SH2结构域7MetLysProHisProTrpPhePheGlyLysIleProArgAlaLysAla151015GluGluMetLeuSerLysGlnArgHisAspGlyAlaPheLeuIleArg202530GluSerGluSerValProGlyAspPheAlaLeuSerValLysPheGly354045AsnAspValGlnHisPheLeuValLeuArgAspGlyAlaGlyLysTyr505560PheLeuTrpValValLysPheAsnSerLeuAsnGluLeuValAspTyr65707580HisArgSerThrSerValSerArgAsnGlnGlnIlePheLeuArgAsp859095IleGluGlnValProGlnGlnProLeuIleAsnGluPhe1001058111PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE野生型人FynSH2结构域8AlaProValAspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysLeu151015GlyArgLysAspAlaGluArgGlnLeuLeuSerPheGlyAsnProArg202530GlyThrPheLeuIleArgGluSerGluThrThrLysGlyAlaTyrSer354045LeuSerIleArgAspTrpAspAspMetLysGlyAspHisValLysHis505560TyrLysIleArgLysLeuAspAsnGlyGlyTyrTyrIleThrThrArg65707580AlaGlnPheGluThrLeuGlnGlnLeuValGlnHisTyrSerGluArg859095AlaAlaGlyLeuCysCysArgLeuValValProCysHisLysGly1001051109111PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURETrM人FynSH2结构域9AlaProValAspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysLeu151015GlyArgLysAspAlaGluArgGlnLeuLeuSerPheGlyAsnProArg202530GlyThrPheLeuIleArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyrAla354045LeuSerIleArgAspTrpAspAspMetLysGlyAspHisValLysHis505560TyrLeuIleArgLysLeuAspAsnGlyGlyTyrTyrIleThrThrArg65707580AlaGlnPheGluThrLeuGlnGlnLeuValGlnHisTyrSerGluArg859095AlaAlaGlyLeuCysCysArgLeuValValProCysHisLysGly10010511010361PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE具有六聚组氨酸和GST标签的野生型人SrcSH2结构域10MetLysHisHisHisHisHisHisAsnThrSerSerAsnSerMetSer151015ProIleLeuGlyTyrTrpLysIleLysGlyLeuValGlnProThrArg202530LeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeuTyrGlu354045ArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeuGlyLeu505560GluPheProAsnLeuProTyrTyrIleAspGlyAspValLysLeuThr65707580GlnSerMetAlaIleIleArgTyrIleAlaAspLysHisAsnMetLeu859095GlyGlyCysProLysGluArgAlaGluIleSerMetLeuGluGlyAla100105110ValLeuAspIleArgTyrGlyValSerArgIleAlaTyrSerLysAsp115120125PheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGluMetLeu130135140LysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsnGlyAsp145150155160HisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAspValVal165170175LeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeuValCys180185190PheLysLysArgIleGluAlaIleProGlnIleAspLysTyrLeuLys195200205SerSerLysTyrIleAlaTrpProLeuGlnGlyTrpGlnAlaThrPhe210215220GlyGlyGlyAspHisProProThrSerGlySerGlyGlyGlyGlyGly225230235240TrpMetSerGluAsnLeuTyrPheGlnGlyAlaMetAspSerIleGln245250255AlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArgGluSerGluArg260265270LeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPheLeuValArgGlu275280285SerGluThrThrLysGlyAlaTyrCysLeuSerValSerAspPheAsp290295300AsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLysIleArgLysLeuAsp305310315320SerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPheAsnSerLeuGln325330335GlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGlyLeuCysHisArg340345350LeuThrThrValCysProThrSerLys35536011361PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE具有六聚组氨酸和GST标签的TrM人SrcSH2结构域11MetLysHisHisHisHisHisHisAsnThrSerSerAsnSerMetSer151015ProIleLeuGlyTyrTrpLysIleLysGlyLeuValGlnProThrArg202530LeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeuTyrGlu354045ArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeuGlyLeu505560GluPheProAsnLeuProTyrTyrIleAspGlyAspValLysLeuThr65707580GlnSerMetAlaIleIleArgTyrIleAlaAspLysHisAsnMetLeu859095GlyGlyCysProLysGluArgAlaGluIleSerMetLeuGluGlyAla100105110ValLeuAspIleArgTyrGlyValSerArgIleAlaTyrSerLysAsp115120125PheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGluMetLeu130135140LysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsnGlyAsp145150155160HisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAspValVal165170175LeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeuValCys180185190PheLysLysArgIleGluAlaIleProGlnIleAspLysTyrLeuLys195200205SerSerLysTyrIleAlaTrpProLeuGlnGlyTrpGlnAlaThrPhe210215220GlyGlyGlyAspHisProProThrSerGlySerGlyGlyGlyGlyGly225230235240TrpMetSerGluAsnLeuTyrPheGlnGlyAlaMetAspSerIleGln245250255AlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArgGluSerGluArg260265270LeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPheLeuValArgGlu275280285SerGluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerValSerAspPheAsp290295300AsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLeuIleArgLysLeuAsp305310315320SerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPheAsnSerLeuGln325330335GlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGlyLeuCysHisArg340345350LeuThrThrValCysProThrSerLys35536012109PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATUREQuadM人SrcSH2结构域12AspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArg151015GluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPhe202530LeuValArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerVal354045SerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLeuIle505560ArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleTrpSerArgThrGlnPhe65707580AsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGly859095LeuCysHisArgLeuThrThrValCysProThrSerLys10010513136PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE具有六聚组氨酸标签的QuadM人SrcSH2结构域13MetLysHisHisHisHisHisHisProMetSerAspTyrAspIlePro151015ThrThrGluAsnLeuTyrPheGlnGlyAlaMetAspSerIleGlnAla202530GluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArgGluSerGluArgLeu354045LeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPheLeuValArgGluSer505560GluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerValSerAspPheAspAsn65707580AlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLeuIleArgLysLeuAspSer859095GlyGlyPheTyrIleTrpSerArgThrGlnPheAsnSerLeuGlnGln100105110LeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGlyLeuCysHisArgLeu115120125ThrThrValCysProThrSerLys13013514109PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATURE双突变型人SrcSH2结构域14AspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArg151015GluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPhe202530LeuValArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerVal354045SerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValLysHisTyrLysIle505560ArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleThrSerArgThrGlnPhe65707580AsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGly859095LeuCysHisArgLeuThrThrValCysProThrSerLys10010515225PRT人工的SH2蛋白质结构域MISC_FEATUREQuadM-TrM人SrcSH2串联结构域15AspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLysIleThrArgArg151015GluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnProArgGlyThrPhe202530LeuValArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyrAlaLeuSerVal354045SerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValArgHisTyrLeuIle505560ArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleTrpSerArgThrGlnPhe65707580AsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLysHisAlaAspGly859095LeuSerHisArgLeuThrThrValSerProThrSerLysGlyGlySer100105110GlyGlySerMetAspSerIleGlnAlaGluGluTrpTyrPheGlyLys115120125IleThrArgArgGluSerGluArgLeuLeuLeuAsnAlaGluAsnPro130135140ArgGlyThrPheLeuValArgGluSerGluThrValLysGlyAlaTyr145150155160AlaLeuSerValSerAspPheAspAsnAlaLysGlyLeuAsnValArg165170175HisTyrLeuIleArgLysLeuAspSerGlyGlyPheTyrIleThrSer180185190ArgThrGlnPheAsnSerLeuGlnGlnLeuValAlaTyrTyrSerLys195200205HisAlaAspGlyLeuSerHisArgLeuThrThrValSerProThrSer210215220Lys225

权利要求：1.一种对测试样品的蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法，所述方法包括：将所述测试样品与SH2超结合体接触，从而使包含于所述测试样品的含pTyr的肽与所述SH2超结合体结合；将所述结合的含pTyr的肽从所述测试样品分离；和鉴定所述分离的含pTyr的肽。2.如权利要求1所述的方法，还包括对所述分离的含pTyr的肽定量。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述鉴定或所述定量包括质谱技术。4.如权利要求3所述的方法，包括多重反应监测、选择性反应监测或平行反应监测技术。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体是哺乳动物SH2结构域的变体。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体是Src、Grb2或FynSH2结构域的变体。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体是三突变型SH2变体。8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体是四突变型SH2变体。9.如权利要求中1-6中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体包含SEQIDNO:5、7、9、11、12、13、14或15的序列。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体包含在融合蛋白内，所述融合蛋白包含一个或多个其他SH2超结合体。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述SH2超结合体固定于固体支持物。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述分离包括高效液相色谱技术或超高效色谱技术。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述样品获自对象。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述对象是人对象。15.如权利要求13或14所述的方法，其中，所述样品是血清、血浆、尿、血液、组织或组织提取物。16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，所述对象将被诊断患有癌症，或已知所述对象患有癌症。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌、肺癌、前列腺癌或白血病。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述样品已经暴露于酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述鉴定包括鉴定对应于特定蛋白质酪氨酸激酶底物的特定含pTyr的肽。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述鉴定包括鉴定对应于特定蛋白质酪氨酸磷酸酶底物的特定含pTyr的肽。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述鉴定包括由蛋白质激酶的活化环或由所述蛋白质激酶的活化环外鉴定含含pTyr的肽。22.如权利要求21所述的方法，其中，所述蛋白质酪氨酸激酶是酪氨酸激酶，丝氨酸苏氨酸激酶，双特异性激酶，MAP激酶或脂质激酶。23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述鉴定包括由免疫受体的ITRM鉴定含pTyr的肽。24.如权利要求23所述的方法，所述ITRM是ITIM、ITSM或ITAM。25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述鉴定包括由蛋白质酪氨酸磷酸酶的调节区鉴定含pTyr的肽。26.如权利要求25所述的方法，其中，所述蛋白质酪氨酸磷酸酶的调节区是正调节区或负调节区。27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，还包括：将对照样品与所述SH2超结合体接触，从而使包含于所述对照样品的含pTyr的肽与所述SH2超结合体结合；将所述结合的含pTyr的肽从所述对照样品分离；鉴定所述分离的含含pTyr的肽；和将针对所述测试样品获得的概况与针对对照样品获得的概况进行比较。28.如权利要求27所述的方法，其中，所述对照样品是：来自与所述测试样品相同来源、但与所述测试样品获取时间点不同的样品，来自与所述测试样品相同来源、但相较于所述测试样品对于药物的暴露不同的样品，来自已知无疾病来源的样品，或来自已知患有疾病或疾病涉及的来源的样品。

百度查询： 李顺成 用于以变体SH2结构域对蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法