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申请/专利权人：云南农业大学

摘要：本发明涉及植物领域，特别涉及一种太白贝母种子的石蜡切片。本方法采用材料为重庆市巫溪县种植的太白贝母种子，主要步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色、脱水透明、封片、观片等。本发明在取材、脱水、透明、浸蜡等步骤中较常规石蜡切片进行了改良，能够较好的固定太白贝母种子细胞组织，切片完整，清晰，易于观察，操作简单，有利于开展太白贝母种质资源解剖结构的观察和研究，为研究太白贝母种子打破休眠的分子机制提供基础。

主权项：1.一种太白贝母种子石蜡切片方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）取材：取饱满无缺口的太白贝母种子作为材料，用流水冲洗干净；（2）固定：将种子材料用吸水纸吸干表面水分，剥去种皮，用刀片去除种胚周围多余胚乳，然后迅速放入盛有FAA固定液的容器中固定，4℃冰箱放置24-27h；（3）脱水：取固定好的种子材料，而后从低到高依次经过盛有50%→60%→70%→80%→90%→100%→100%系列浓度乙醇溶液的容器进行梯度脱水，每个浓度的梯度脱水时间为30min；（4）透明：采用盛有无水乙醇和二甲苯混合液的容器进行逐级透明，无水乙醇与二甲苯的比例依次为：4∶1→3∶2→2∶3→1∶4→0∶5→0∶5，每级透明时间为6h；（5）浸蜡：从种子材料透明彻底的容器中倒出12或23的二甲苯，然后将熔点为52-54℃的石蜡碎屑加入容器中，一直加到二甲苯完全饱和，容器置于混合蜡液在40℃下浸蜡24h，之后再用混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72h；混合蜡液由熔点为50-52℃和熔点为58-60℃的石蜡按重量比1∶1的比例融合而成；（6）包埋：种子材料浸蜡结束后马上用镊子转移到装有液态混合石蜡的纸盒中，调整好种子材料位置，再将纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶；（7）切片：根据种子材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片得到蜡带，控制切片厚度为6-8μm；（8）粘片：在洁净的载玻片上均匀薄涂一层质量体积比为2%的明胶，将蜡带放在载玻片上，用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片在30-35℃的水浴锅上放置2h，使蜡带光滑面紧贴载玻片之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干至少12h；（9）脱蜡：将上一步骤处理的切片依次放置于盛有纯二甲苯溶液→二甲苯与无水乙醇1∶1混合溶液→无水乙醇溶液→90%乙醇溶液→80%乙醇溶液→70%乙醇溶液→50%乙醇溶液→30%乙醇溶液→蒸馏水的容器中分别进行脱蜡，在每个容器的脱蜡时间为10min；（10）染色：脱蜡后的切片依次放置于20mgmL的铁矾溶液中30min→5mgmL的苏木精溶液中30min→20mgmL的铁矾溶液中2min进行染色；.（11）脱水透明：染色后的切片依次经过盛有30%→50%→60%→70%→80%→90%→100%系列浓度乙醇溶液的容器中进行逐级脱水，每级脱水时间10min；后将切片依次经过无水乙醇与二甲苯的比例分别为：1∶1和0∶5的溶液中进行逐级透明，每级透明时间10min；（12）封片：从二甲苯透明的容器中取出切片，在二甲苯挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

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