买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：北京锦篮基因科技有限公司

摘要：本发明提供重组腺相关病毒介导的Leber遗传性视神经病变治疗药物。重组腺相关病毒载体携带细胞核表达ND4蛋白表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体经玻璃体腔注射能够高效地导入视网膜中，持续稳定地表达产生ND4蛋白，定位于线粒体，缓解或恢复ND4基因突变带来的不良症状。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为新的Leber遗传性视神经病变治疗药物。

主权项：1.人线粒体ND4基因的细胞核表达框，其特征在于，所述表达框的组成为：（Ⅰ）细胞核启动子；（Ⅱ）含有线粒体定位肽编码序列和细胞核表达ND4基因编码区序列的融合序列；和（III）线粒体表面锚定mRNA编码序列，其中所述细胞核启动子为SEQIDNO:1的CAM启动子，其中所述的融合序列由SEQIDNO.6组成，且其中所述的线粒体表面锚定mRNA编码序列由SEQIDNO.4组成。

全文数据：Leber遗传性视神经病变的基因药物技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于重组腺相关病毒载体的Leber遗传性视神经病变基因药物。背景技术Leber遗传性视神经病变（Leber’sHereditaryOpticNeuropathy，LHON）（OMIM535000）是一种累及视网膜、巩膜筛板前部乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性病变的母系遗传病（即母系后代发病而父系后代不发病）（Yu-Wai-ManP，etal.ProgRetinEyeRes.2011;302:81-114）。1871年德国眼科医生LeberT首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性（LeberT.Graefe’sArchOphthalmol.1871;17:249-291.）。LHON主要累及青壮年男性，发病年龄常在15-20岁，临床上主要表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，可同时伴有中心视野缺失及色觉障碍。患者可呈现1级、2级、3级到4级等不同程度的视力损伤，病程可表现为视力突然完全丧失，也可呈渐进性下降（Yu-Wai-ManP,etal.JMedGenet.2009;463:145-158.）。1972年，EricksonRP等发现LHON呈母系遗传的特征，提示mtDNA（线粒体DNA）突变为LHON发病的主要分子基础。但是，携带相同mtDNA突变的不同家系和同一家系的不同成员之间LHON的外显率和表现度具有显著性差异，这表明其他因素（如核基因、线粒体单体型和或环境因素等）在LHON发病过程中起着重要作用（Yu-Wai-ManP，etal.ProgRetinEyeRes.2011;302:81-114）。mtDNA突变是LHON发病的分子基础。自1988年WallaceDC等在LHON家系中首次发现MT-ND4m.11778GA突变以来（WallaceDC，etal.Science.1988;2424884:1427-1430.），目前已发现60多个LHON相关的mtDNA突变（Ruiz-PesiniE,etal.NucleicAcidsRes.2007;35:D823-828.），这些突变分为原发突变和继发突变。原发突变，如MT-ND1m.3460GAHuoponenK,etal.AmJHumGenet.1991;486:1147-1153.、MT-ND4m.11778GAWallaceDC，etal.Science.1988;2424884:1427-1430.和MT-ND6m.14484TC（JohnsDR,etal.BiochemBiophysResCommun.1992;1873:1551-1557.）是LHON的3个原发突变，仅发生在LHON家系中，他们改变了进化上中度或高度保守的氨基酸，导致呼吸链复合体I结构和功能改变，造成线粒体功能障碍，最终导致LHON的发生。继发突变，如MT-TMm.4435AGQuJ,etal.InvestOphthalmolVisSci.2006;472:475-483.，MT-TTm.15951AGLiR,etal.Gene.2006;3761:79-86.常与原发突变协同作用而影响LHON的表型表达，这类突变在LHON家系中存在，但也在正常人群中以低于LHON病人的频率出现。文献报道结果显示不同的国家LHON的发病率存在差异。英格兰东北地区LHON的发病率约为125000（ChinneryPF，etal.AnnNeurol.2000;482:188-193.ManPYW,etal.AmJHumGenet.2003;722:333-339.）,荷兰的发病率为139000SpruijtL,etal.AmJOphthalmol.2006;1414:676-682.,而芬兰发病率为150000PuomilaA,etal.EurJHumGenet.2007;1510:1079-1089.。在我国和亚洲其他地区,目前尚未见流行病学调查资料。超过95%的LHON患者由3个mtDNA的原发突变（m.11778GA、m.3460GA和m.14484TC）引起。不同地区LHON患者人群中这3个原发突变所占的比例不尽相同。在欧洲,m.11778GA引起的LHON患者占56.6%,m.3460GA和m.14484TC突变致病的患者分别占22.6%和20.8%HudsonG,etal.AmJHumGenet.2007;812:228-233.;在我国LHON人群中,携带m.11778GA突变的患者所占比率显著高于欧洲LHON人群,可达90.2%,而m.3460GA和m.14484TC突变在我国LHON患者人群中比率分别为1.1%和8.7%YuDD,etal.PLoSONE.2010;510:e13426.YuD,etal.Neurogenetics.2010;113:349-356.JiY,etal.AmJHumGenet.2008;836:760-768.。由于LHON多由基因突变引起，目前并没有有效的治疗方法。通常建议戒烟戒酒、尝试线粒体呼吸链障碍治疗药物、神经保护剂等治疗手段进行辅助治疗。基因治疗是治疗LHON最有希望的治疗方式之一。主要的难点在于：1、LHON突变基因位于mtDNA，如何高效地将野生型基因导入线粒体，并保证导入基因的长期稳定表达；2、如果选择细胞核异位表达LHON致病突变基因的野生型基因，那么如何保证表达蛋白正确地定位于线粒体内，并发挥功能；3、如何高效地将LHON致病突变基因的野生型基因转导至细胞核内或线粒体内。针对这些难点，不少的研究者做了不少的尝试。为了将基因导入线粒体中，主要的策略是改造AAV载体。把线粒体定位序列插入AAV载体的外壳蛋白2（VP2）的N端，得到一种进入细胞后定位于细胞线粒体的AAV载体，外加线粒体特异性启动子调控LHON正确基因（ND4基因）的表达，实现了ND4基因高效导入线粒体（YuH，etal.ProcNatlAcadSciUSA.2012;10920:E1238-1247.YuH,etal.MolVis.2012;18:1668-1683.YuH，etal.MolVis.2013;19:1482-1491.YuH,etal.SciRep.2018;81:5587.）。对于核基因异位表达蛋白高效定位于线粒体的问题，主要通过在表达蛋白的N端添加线粒体定位肽和在mRNA的3’UTR（untranslatedregion，UTR）加入线粒体锚定RNA序列来解决。KoilkondaRD等通过在ND4蛋白的N端加入ATP1蛋白的线粒体定位序列，用双链AAV载体携带设计的ND4表达框，使表达ND4蛋白定位于视网膜神经节细胞（RGC）线粒体中KoilkondaRD,etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.。BonnetC等则通过在ND4蛋白的N端引入人COX10蛋白的线粒体定位肽以及在ND4表达框的3’UTR中加入人COX10mRNA的线粒体锚定序列，用单链AAV载体携带构建的ND4表达框，也实现了表达ND4蛋白定位成纤维细胞线粒体中BonnetC，etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.。两个研究小组的主要差异在于ND4表达框的设计和AAV载体的选择。KoilkondaRD等主要通过线粒体定位肽来实现表达ND4蛋白的线粒体靶向（KoilkondaRD,etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.），而BonnetC等除了应用线粒体定位肽外，还利用了线粒体锚定RNA序列（BonnetC，etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.），理论上效率更高，但是增加了表达框的碱基数，导致只能采用单链AAV载体携带。目前基于上述两种设计的基因治疗药物都有相应的专利报道，且进入临床试验阶段。单独应用线粒体定位肽设计的LHON基因治疗药物的临床1期试验结果表明，设计的LHON基因药物（FeuerWJ,etal.Ophthalmology.2016;1233:558-570.GuyJ,etal.Ophthalmology.2017;12411:1621-1634.）安全有效。结合线粒体定位肽和线粒体表面锚定RNA设计的LHON基因药物由两个独立的研究团队分别进入临床试验或临床研究阶段。法国GenSight公司的GS010（rAAV22-ND4）已进入临床3期试验。2018年6月公布的临床3期试验结果显示GS010均已达到预期的临床试验终点（https:www.gensight-biologics.comwp-contentuploads201806GENSIGHT-BIOLOGICS-PR-REVERSE-KOL-Event-Highlights-vdef.pdf），且安全性良好（VignalC,etal.Ophthalmology.2018;1256:945-947.）。华中科技大学同济医院的李斌教授带领团队设计的rAAV2-ND4在9个LHON患者中进行了小规模的临床研究。研究结果表明rAAV2-ND4对LHON安全有效，为后续更大规模的临床研究实验奠定了基础YangS,etal.EBioMedicine.2016;10:258-268.WanX,etal.SciRep.2016;6:21587.。本发明拟在上述已有LHON基因治疗工作的基础上，提出更为高效的LHON基因治疗药物设计。基因治疗药物的设计采用细胞核异位表达产生ND4mRNA翻译蛋白定位于线粒体策略。为此我们拟设计独特的ND4基因表达框。该表达框采用更加高效的启动子、对ND4基因编码序列进行人源表达优化、选择两种不同大小的线粒体表面锚定RNA序列以及在ND4蛋白编码序列的5’端前添加线粒体定位肽编码序列等设计。得到序列长度一大一小的两种表达框设计。长度更大的表达框用单链AAV载体携带，长度较小的表达框用双链AAV载体携带。除了AAV2血清型载体外，我们还选择AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳，玻璃体腔注射对视网膜神经节细胞转导效率更高。然后，将设计好的药物在LHON模型小鼠中评价其有效性。具体的过程如本发明实施例所示。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.HogganMD,etal.ProcNatlSciUSA.1966;55:1467-1474.）。AAV是微小病毒科Parvovirus成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNARoseJA,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1969;64:863-869.，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒GeoffroyMC,etal.CurrGeneTher.2005;53:265-271.，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态ChioriniJA,etal.CurrTopMicrobiolImmunol.1996;218:25-33.，而不产生子代病毒。最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”（invertedterminalrepeat,ITR），呈回文-发卡结构LusbyE,etal.JVirol.1980;34:402-409.。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中SamulskiRJ,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1982;79:2077-2081.LaughlinCA,etal.Gene.1983;23:65-73.。ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用XiaoX,etal.JVirol.1997;712:941-948.。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Repbindingsite，RBS）和末端解链位点trs（terminalresolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口LindenRM,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1996;9315:7966-7972.。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用AshktorabH,etal.JVirol.1989;637:3034-3039.。AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区SrivastavaA,etal.JVirol.1983;452:555-564.。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminalresolutionsite）和GAGY重复基序（repeatmotif）特异性结合HüserD,etal.PLoSPathog.2010;67:e1000985.，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminalresolutionsite）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（WangZ,etal.GeneTher.2003;1026:2105-2111.McCartyDM,etal.GeneTher.2003;1026:2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementaryAAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-strandedAAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织WuZ,etal.MolTher.2006;143:316-327.。有些血清型AAV载体（如AAV2）经玻璃体腔注射后能够有效地转导视网膜中靠近玻璃体侧的神经节细胞（HellströmM,etal.GeneTherapy.2009;16:521-532.）。某些血清型AAV载体（如AAV8）通过视网膜下腔注射后可以高效地转导感光细胞和视网膜色素上皮细胞（NatkunarajahM,etal.GeneTherapy.2008;15:463-467.）。而且将AAV2载体外壳蛋白表面突出的酪氨酸突变为苯丙氨酸，能够提高AAV载体经玻璃体腔注射或视网膜下注射后对视网膜细胞的转导效率，如将AAV2载体外壳表面的1个酪氨酸突变为苯丙氨酸（Petrs-SilvaH,etal.MolecularTherapy.2009;173:463-471.）、AAV2载体外壳表面的3个酪氨酸突变为苯丙氨酸以及AAV2载体外壳表面的4个酪氨酸突变为苯丙氨酸（Petrs-SilvaH,etal.MolecularTherapy.2011;192:293-301.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性GruntmanAM,etal.HumGeneTherMethods.2015;262:71-76.，容易开发出稳定性较高的生物制品。AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirustype1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（YuanZ,etal.HumGeneTher,2011,225:613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44（5）：506-509。ConwayJE,etal.GeneTher,1999,6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（WustnerJT,etal.MolTher,2002,64:510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的repcap基因和AAV的反向末端序列（Invertedterminalrepeat，ITR）外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（BoothMJ,etal.GeneTher,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（ThomasDL,etal.GeneTher,2009,20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（ChenH.MolTher.2008;165:924-930.GalibertL,etal.JInvertebrPathol,2011,107Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（MietzschM,etal.HumGeneTher.2014;25:212-222.MietzschM,etal.HumGeneTher.2015;2610:688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有204项（http:www.abedia.comwileyvectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-HerttualaS.MolTher.2012;2010:1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https:www.fda.govnewseventsnewsroompressannouncementsucm589467.htm）。血友病B（KayMA,etal.NatGenet.2000;243:257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。本发明中，我们选择AAV载体来携带ND4基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（SalgenikM,etal.MicrobiolSpectr.2015;34.），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（ChenZY,etal.MolTher.2001;33:403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过玻璃体腔注射能够高效地转导视网膜神经节细胞（PangJJ,etal.VisionRes.2008;483:377-385.NatkunarajahM,etal.GeneTherapy.2008;15:463-467.），保证ND4基因表达框能够在神经节细胞中表达产生ND4蛋白，恢复神经节细胞功能，从而达到治疗LHON的目的。基于此，本发明提出了新型LHON基因治疗药物设计。设计基因药物的结构为携带人工设计的ND4基因表达框的重组腺相关病毒载体。基因药物导入体内后，在细胞核中异位表达产生ND4mRNA，经核糖体翻译得到ND4蛋白，定位于线粒体中。选用的重组腺相关病毒载体血清型除AAV2外，还包括AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳。三种血清型AAV载体经玻璃体腔注射后可高效地转导视网膜中神经节细胞，表达产生正常的ND4蛋白。人工设计的ND4基因表达框包含一大一小两种不同的长度结构。较大的ND4基因表达框中包含人巨细胞病毒启动子（CMV启动子）、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及COX10基因mRNA的3’UTR（3’untranslatedregion，3’非编码区）（BonnetC，etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.）。较小的ND4基因表达框中含有自主设计的序列短小启动子、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及序列长度小于200bp的ATP5B基因的3’UTR序列（SylvestreJ,etal.MolecularBiologyoftheCell,2003,149:3848.）。采用单链AAV载体携带较大的ND4基因表达框；采用自身互补的双链AAV载体携带较小的ND4基因表达框。将设计多种LHON基因药物同含有ND4突变（11778GA）表达框的AAV载体（scAAV2-HSP-mND4）经玻璃体腔注射至小鼠中，评价设计LHON基因药物的有效性。结果表明设计LHON基因药物能够有效地抑制scAAV2-HSP-mND4对小鼠视网膜中神经节细胞的破坏作用，保护视网膜的正常生理功能，为LHON的治疗提供了新的选择。发明内容有鉴于此，本发明提供Leber遗传性视神经病变的基因治疗药物。本发明提出了新型LHON基因治疗药物设计，用重组腺相关病毒载体携带人为设计的ND4基因表达框。将该基因药物导入体内后，在细胞核中异位表达产生ND4mRNA，经核糖体翻译得到ND4蛋白，定位于线粒体中，补偿突变ND4蛋白的功能，从而达到缓解或治疗LHON的目的。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过玻璃体腔注射能高效地把药物效应元件导入视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）的特点，实现药物效应元件高效表达产生治疗作用的ND4蛋白。为了实现ND4蛋白表达框的高效表达，根据不同AAV载体的转导特点，选用的AAV载体主要为AAV2和AAV2外壳突变体载体，AAV2外壳突变体载体具体为AAV2（3YF）和AAV2（4YF），即AAV2载体外壳蛋白1（VP1）3个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（3YF）以及AAV2载体外壳蛋白1（VP1）4个表面突出酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV2（4YF）的AAV外壳。本发明实施例6中，我们展示了不同AAV外壳对LHON基因药物有效性影响的研究结果。本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征还在于，该药物经玻璃体腔注射后能高效地在视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）表达产生ND4蛋白。为了实现ND4蛋白的高效表达，人为设计了一大一小两种不同长度结构的ND4基因表达框。较大的ND4基因表达框中包含人巨细胞病毒启动子（CMV启动子）、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及人COX10基因mRNA的3’UTR（3’untranslatedregion，3’非编码区）（BonnetC，etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.）。较小的ND4基因表达框中含有自主设计的序列短小启动子、人源密码子优化的融合线粒体定位肽和ND4蛋白序列的融合蛋白编码序列以及序列长度小于200bp的人ATP5B基因的3’UTR序列（SylvestreJ,etal.MolecularBiologyoftheCell,2003,149:3848.）。采用单链AAV载体携带较大的ND4基因表达框；采用自身互补的双链AAV载体携带较小的ND4基因表达框。本发明实施例5和实施例6的实验结果表明两种不同设计的表达框都能够在视网膜细胞中有效表达产生ND4蛋白，缓解或恢复LHON的病理改变。本发明提供了治疗Leber遗传性视神经病变（LHON）的基因药物，其特征还在于，该药物经玻璃体腔注射后能高效地转导视网膜细胞（尤其是视网膜神经节细胞）。由于LHON的靶细胞神经节细胞位于视网膜靠近玻璃体侧，因此重组AAV病毒经玻璃体腔注射后能够有效地感染神经节细胞。相比于视网膜下腔注射，玻璃体腔注射操作简单，对视网膜损伤小，在临床应用中具有明显优势。本发明实施例4用EGFP报告基因证明了玻璃体腔注射重组AAV病毒（实施例中为AAV2）能够有效地转导视网膜神经节细胞。实施例5和实例6中采用玻璃体腔注射评价了设计LHON基因药物的有效性，实验结果表明玻璃体腔注射方式能够使重组AAV病毒高效地转导视网膜神经节细胞，表达产生ND4蛋白，缓解或恢复ND4突变蛋白带来的LHON病理改变。本发明提供的LHON基因治疗药物，其特征还在于，经玻璃体腔一次给药就能够长期持续地在小鼠视网膜中表达产生ND4蛋白，恢复或延缓ND4基因突变带来的不良症状。本发明用到的重要原始实验材料如下所示：pHelper质粒，来源于AAVHelperFreeSystem（AgilentTechnologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VARNA等。pAAV-R2C2质粒，为AAVHelperFreeSystem（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒，由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。为了明确指示pAAV-RC质粒的功能，将pAAV-RC质粒重新命名为pAAV-R2C2质粒。pAAV-R2C2质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。pAAV-DJ质粒，包含完整的AAVDJ的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVDJ病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVDJ外壳蛋白。由本公司购自美国CellBiolabs公司并保存。C57BL6J小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型对照和实验用动物。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（DongX,etal.PLoSONE.2010;510:e13479.）。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMVpromoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。图2pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minutevirusofmice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQIDNO.1。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。图3pAAV-CMV-EGFP-COX10载体结构示意图ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMVpromoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。MTS，来源于人COX10蛋白的线粒体定位肽编码DNA序列，详细序列信息见SEQIDNO.2。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码序列。COX10polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQIDNO.3。图4pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minutevirusofmice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQIDNO.1。MTS，来源于人COX10蛋白的线粒体定位肽编码DNA序列，详细序列信息见SEQIDNO.2。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码序列。ATP5B3’UTR，人ATP5B基因的3’非翻译区，作为基因转录的终止加尾信号，序列信息见SEQIDNO.4。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。图5pAAV-CMV-ND4-COX10载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMVpromoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。ND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的核基因编码序列，序列信息见SEQIDNO.5。COX10polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQIDNO.3。图6pAAV-CMV-ocND4-COX10载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMVpromoter，人巨细胞病毒早期启动子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。ocND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的人源优化后的核基因编码序列，序列信息见SEQIDNO.6。COX10polyA，人COX10基因的加尾信号序列，序列信息见SEQIDNO.3。图7pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。CAM，人工设计的启动子，由人巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和小鼠细小病毒内含子（minutevirusofmice，mvm）拼接而成，序列信息见SEQIDNO.1。ocND4，人COX10蛋白线粒体定位肽和人线粒体ND4蛋白序列融合序列的人源优化后的核基因编码序列，序列信息见SEQIDNO.6。ATP5B3’UTR，人ATP5B基因的3’非翻译区，作为基因转录的终止加尾信号，序列信息见SEQIDNO.4。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。图8pscAAV-HSP-mND4载体结构示意图。ITR，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的ITR，抑制AAV包装过程中ITR序列的切割，提高包装得到病毒携带自身互补的双链基因组的概率。HSP，人线粒体重链启动子，序列信息见SEQIDNO.7。mND4，人线粒体突变ND4基因（G11778A），序列信息见SEQIDNO.8。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI、SwaI和ApaI均为限制性酶切位点。图9pAAV-VP2A-COX8-EGFP载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。COX8-EGFP，人COX8蛋白线粒体定位肽和绿色荧光蛋白融合蛋白序列的编码序列，序列信息见SEQIDNO.9。VP2A-COX8-EGFP，人为设计的含有COX8-EGFP序列的AAV2的VP2（三种病毒外壳蛋白组分之一，分子量第二大）。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。图10pAAV-VP1-VP3载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。VP1-VP3，将AAV2病毒的cap基因序列中VP2起始密码子由“ACG”突变为“GCG”得到，序列信息详见SEQIDNO.10。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。图11pAAV-R2C2载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2，AAV2病毒的cap基因序列，序列信息详见SEQIDNO.11。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。图12pAAV-R2C2-3YF载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2-3YF，将AAV2病毒的cap基因序列中VP1序列中730、500、444位酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子，序列信息详见SEQIDNO.12。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。图13pAAV-R2C2-4YF载体结构示意图。Rep2，AAV2病毒的rep基因序列。Cap2-4YF，将AAV2病毒的cap基因序列中VP1序列中730、500、444和272位酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子，序列信息详见SEQIDNO.13。HindIII、PmeI，限制性酶切位点。图14异位表达绿色荧光蛋白亚细胞定位观察结果。采用三质粒包装系统，将pAAV-CMV-EGFP-COX10和pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B。包装得到的AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒分别以1×105vgcell的剂量感染人成纤维细胞BJ细胞。病毒转导细胞72h后，共聚焦显微镜（LeicaTSC4D）观察绿色荧光蛋白表达情况及在细胞中分布。用ATP合成酶α亚基定位细胞中线粒体。同一视野下，细胞内绿色荧光蛋白分布和ATP合成酶α亚基分布的重叠区域即为线粒体中绿色荧光蛋白的分布区域。图14A，转导AAVDJ-EGFP-COX10病毒的BJ细胞的绿色荧光蛋白表达情况；图14B，同一视野下，转导AAVDJ-EGFP-COX10病毒的BJ细胞的ATP合成酶α亚基分布（红色表示）；图14C，图14A和图14B叠加结果，黄色部分表示表达绿色荧光蛋白的线粒体；图14D，转导scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒的BJ细胞的绿色荧光蛋白表达情况；图14E，同一视野下，转导scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒的BJ细胞的ATP合成酶α亚基分布（红色表示）；图14F，图14D和图14E叠加结果，黄色部分表示表达绿色荧光蛋白的线粒体。图15玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B转导小鼠视网膜细胞结果。采用三质粒包装系统，将pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成scAAV2-EGFP-ATP5B。包装得到的scAAV2-EGFP-ATP5B病毒分别以2×109vg1μL只眼的剂量经玻璃体腔注射C57BL6J小鼠。注射病毒2周后，处死小鼠，分离小鼠视网膜，冰冻切片后，用细胞核染料DAPI处理标记细胞核，荧光显微镜下分别观察绿色荧光蛋白表达情况和DAPI染料结合情况。同一视野下两种观察情况下成像结果叠加，得到如图15所示的结果。GCL，ganglioncelllayer，神经节细胞层；INL，innernuclearcell，内核细胞层；ONL，outernuclearlayer，外核细胞层；RPE，retinalpigmentepithelium，视网膜色素上皮细胞层。图16不同病毒组合注射C57BL6J小鼠后图形视网膜电位振幅变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。图17不同病毒组合注射C57BL6J小鼠后图形视网膜电位延迟时间变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位延迟时间。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。图18不同病毒组合注射C57BL6J小鼠后视网膜中GCL和IPL细胞层厚度变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，用光学相干断层成像术（opticalcoherencetomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。GCL，ganglioncelllayer，神经节细胞层；IPL，innerplexiformlayers，内丛状层。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；EGFP-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠；ND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠；ocND4-COX10，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ocND4-COX10病毒小鼠；ocND4-ATP5B，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠。图19不同血清型AAV病毒组合注射C57BL6J小鼠后图形视网膜电位振幅变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV23YF-ocND4-ATP5B以及scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV23YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV24YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠。图20不同血清型AAV病毒组合注射C57BL6J小鼠后图形视网膜电位延迟时间变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV23YF-ocND4-ATP5B以及scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位延迟时间。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV23YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV24YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠。图21不同血清型AAV病毒组合注射C57BL6J小鼠后视网膜中GCL和IPL细胞层厚度变化。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B等4种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV23YF-ocND4-ATP5B以及scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，用光学相干断层成像术（opticalcoherencetomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。GCL，ganglioncelllayer，神经节细胞层；IPL，innerplexiformlayers，内丛状层。Control，未注射病毒C57BL6J小鼠；AAV2，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV23YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠；AAV24YF，前后分别注射scAAV2-HSP-mND4病毒和scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠。具体实施方式本发明公开了Leber遗传性视神经病变的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1质粒载体构建首先我们构建本发明实施例中需要用到的AAV载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10（图3）、pscAVV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pAAV-CMV-ND4-COX10（图5）、pAAV-CMV-ocND4-COX10（图6）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8）），然后构建了包装靶向线粒体的AAV载体包装外壳质粒（pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）和pAAV-VP1-VP3（图10））以及AAV2外壳中酪氨酸突变为苯丙氨酸的AAV载体包装外壳质粒（pAAV-R2C2-3YF（图12）、pAAV-R2C2-4YF（图13））。其中单链AAV载体包装载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10（图3）、pAAV-CMV-ND4-COX10（图5）、pAAV-CMV-ocND4-COX10（图6））以公司保存的pAAV2neo（图1）为基本骨架。双链AAV载体包装质粒（pscAVV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8））则是在pscAAV-CAM载体（图2）的基础上构建而来，pscAAV-CAM载体的前体质粒是公司保存的pAAV2neo（图1）。（1）单链AAV载体质粒构建为了使表达蛋白有效地靶向线粒体，我们在表达蛋白的N端融合了线粒体定位肽序列（mitochondrialtargetingsignalpeptide，MTS）以及在表达蛋白mRNA的3’UTR（3’untranslatedregion）加入线粒体表面靶向mRNA序列。MTS序列来源于人COX10蛋白的MTS序列，长度为28个氨基酸，编码氨基酸序列详见SEQIDNO.2。线粒体表面靶向mRNA序列来源于人COX10mRNA（GenBankID：U09466.1）序列，序列信息详见SEQIDNO.3。MTS序列和线粒体表面靶向mRNA序列选择参考文献（BonnetC,etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.）。根据上述思路，我们首先构建了靶向线粒体的绿色荧光蛋白（EGFP）表达AAV载体pAAV-CMV-EGFP-COX10。设计合成了含有人COX10蛋白MTS编码序列（SEQIDNO.2）、EGFP编码序列（SEQIDNO.14）和人COX10mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQIDNO.3）的融合序列MTS-EGFP-COX10（SEQIDNO.15）。在MTS-EGFP-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-EGFP-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-EGFP-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-EGFP-COX10载体，回收长度为2.2kb的MTS-EGFP-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-EGFP-COX10质粒（图3）。接下来，我们构建了靶向线粒体的ND4表达AAV载体pAAV-CMV-ND4-COX10。设计合成了含有人COX10蛋白MTS编码序列（SEQIDNO.2）、ND4核基因编码序列（SEQIDNO.5）和人COX10mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQIDNO.3）的融合序列MTS-ND4-COX10（SEQIDNO.16）。在MTS-ND4-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ND4-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ND4-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ND4-COX10载体，回收长度为2.9kb的MTS-ND4-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-ND4-COX10质粒（图5）。最后，我们构建了人源优化的ND4表达AAV载体pAAV-CMV-ocND4-COX10。设计合成了含有人COX10蛋白MTS编码序列（SEQIDNO.2）、人源化的ND4核基因编码序列ocND4（SEQIDNO.6）和人COX10mRNA中靶向线粒体表面序列（SEQIDNO.3）的融合序列MTS-ocND4-COX10（SEQIDNO.17）。在MTS-ocND4-COX10序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ocND4-COX10序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ocND4-COX10载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ocND4-COX10载体，回收长度为2.9kb的MTS-ocND4-COX10序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-CMV-ocND4-COX10质粒（图6）。（2）双链AAV载体质粒构建为了构建双链AAV载体，我们首先以pAAV2neo为基础，构建通用的pscAAV-CAM质粒。构建过程如下，以AAV2基因组（GenBankNo.AF043303）中的3’端ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列（WangZ,etal.GeneTher.2003;10:2105-2111.），得到ΔITR序列（SEQIDNo.18）。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-2127bp之间序列（靠近BGHpolyA的ITR和SwaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列ΔITR-BS（SEQIDNo.19）。在ΔITR-BS融合序列两端分别添加BamHI和SwaI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57simple载体，获得pUC57-ΔITR-BS。BamHI和SwaI双酶切分别消化pUC57-ΔITR-BS载体和pAAV2neo载体，回收ΔITR-BS片段以及切去ITR序列的pAAV2neo载体片段。将回收ΔITR-BS片段同切去ITR序列的pAAV2neo载体片段连接，转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV2neo载体。将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接，得到CAM启动子序列，序列信息见SEQIDNo.1。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体，回收CAM片段和切去CMV启动子的pscAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coliJM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pscAAV-CAM（图2）。接下来，我们以构建获得的pscAAV-CAM（图2）为基础，构建pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）、pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B（图7）、pscAAV-HSP-mND4（图8）载体。为了使表达蛋白有效地靶向线粒体，我们在表达蛋白的N端融合了线粒体定位肽序列（mitochondrialtargetingsignalpeptide，MTS）以及在表达蛋白mRNA的3’UTR（3’untranslatedregion）加入线粒体表面靶向mRNA序列。MTS序列来源于人COX10蛋白的MTS序列，长度为28个氨基酸，编码氨基酸序列详见SEQIDNO.2。线粒体表面靶向mRNA序列来源于人ATP5BmRNA（GenBankID：NM_001686.3）序列，序列信息详见SEQIDNO.4。MTS序列选择参考文献（BonnetC,etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.）。线粒体表面靶向mRNA序列选择参考文献（SylvestreJ,etal.MolBiolCell.2003;149:3848-3856.）。根据上述思路构建靶向线粒体的绿色荧光蛋白（EGFP）表达AAV载体pAAV-CAM-EGFP-ATP5B。设计合成了含有人COX10蛋白MTS编码序列（SEQIDNO.2）、EGFP编码序列（SEQIDNO.14）和人ATP5BmRNA中靶向线粒体表面序列（SEQIDNO.4）的融合序列MTS-EGFP-ATP5B（SEQIDNO.20）。在MTS-EGFP-ATP5B序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-EGFP-ATP5B序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-EGFP-ATP5B载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-EGFP-ATP5B载体，回收长度约为1.0kb的MTS-EGFP-ATP5B序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.6kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B（图4）。进一步，我们构建了人源优化的ND4表达双链AAV载体pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B。设计合成了含有人COX10蛋白MTS编码序列（SEQIDNO.2）、人源化的ND4核基因编码序列ocND4（SEQIDNO.6）和人ATP5BmRNA中靶向线粒体表面序列（SEQIDNO.4）的融合序列MTS-ocND4-ATP5B（SEQIDNO.21）。在MTS-ocND4-ATP5B序列的两端分别添加KpnI和BamHI酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的MTS-ocND4-ATP5B序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-MTS-ocND4-ATP5B载体。KpnI和BamHI双酶切消化pUC57-1.8K-MTS-ocND4-ATP5B载体，回收长度为1.6kb的MTS-ocND4-ATP5B序列片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.6kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B质粒（图7）。最后，我们构建了用于包装转导线粒体的AAV载体质粒pscAAV-HSP-mND4（图8）。设计合成了含有人线粒体重链启动子（HSP）（SEQIDNO.7）、人线粒体突变ND4基因（G11778A）mND4（SEQIDNO.7）的融合序列HSP-mND4（SEQIDNO.22）。HSP序列来源于人线粒体基因组（GenBankID：MF152677.1）。mND4序列由人线粒体基因组（GenBankID：MF152677.1）中ND4基因突变而来，将基因组中11778位的“G”突变为“A”。在HSP-mND4序列的两端分别添加XhoI和BglII酶切位点，以方便克隆。将添加酶切位点的HSP-mND4序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57-1.8K（南京金斯瑞生物科技有限公司）载体，得到pUC57-1.8K-HSP-mND4载体。XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-HSP-mND4载体，回收长度为1.4kb的HSP-mND4序列片段备用。XhoI和BglII双酶切消化pscAAV2neo-CAM载体，回收长度为6.1kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pscAAV-HSP-mND4（图8）。（3）AAV载体包装外壳质粒构建参考文献（WarringtonKHJr，etal.JVirol.2004;7812:6595-6609.YuH，etal.MolVis.2012;18:1668-1683.），我们首先构建了高效靶向转导线粒体的AAV载体包装外壳质粒之一，pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）。以AAVHelperFreeSystem中的pAAV-R2C2质粒（AgilentTechnologies，美国）为基础，参考文献（WarringtonKHJr，etal.JVirol.2004;7812:6595-6609.）将VP1蛋白中的第1位甲硫氨酸突变为亮氨酸（对应密码子由“ATG”突变为“CTG”）、第138位苏氨酸突变为甲硫氨酸（对应密码子由“ACG”突变为“ATG”），得到的序列命名为VP2A，序列信息见SEQIDNO.23。依据文献（WarringtonKHJr，etal.JVirol.2004;7812:6595-6609.）在VP2A基因第414位和第415位碱基之间（即第138位甲硫氨酸密码子后）插入“COX8-EGFP”编码序列，得到VP2A-COX8-EGFP，序列信息见SEQIDNO.24。COX8-EGFP序列来源参考文献（YuH，etal.MolVis.2012;18:1668-1683.），序列信息详见SEQIDNO.8。用VP2A-COX8-EGFP序列替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得质粒pAAV-VP2A-COX8-EGFP的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-VP2A-COX8-EGFP中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列命名为VP2A-COX8-EGFP-HP，序列信息详见SEQIDNO.25。将合成VP2A-COX8-EGFP-HP序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-VP2A-COX8-EGFP-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-VP2A-COX8-EGFP-HP载体，回收长度为3.4kb的VP2A-COX8-EGFP-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-VP2A-COX8-EGFP（图9）。接下来，我们构建了另一个高效靶向转导线粒体的AAV载体包装外壳质粒pAAV-VP1-VP3（图10）。以AAVHelperFreeSystem中的pAAV-R2C2质粒（AgilentTechnologies，美国）为基础，参考文献（WarringtonKHJr，etal.JVirol.2004;7812:6595-6609.）将VP1蛋白中的第138位苏氨酸突变为丙氨酸（对应密码子由“ACG”突变为“GCG”），得到的序列命名为VP1-VP3，序列信息见SEQIDNO.10。用VP1-VP3序列替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得质粒pAAV-VP1-VP3的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-VP1-VP3中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列命名为VP1-VP3-HP，序列信息详见SEQIDNO.26。将合成VP1-VP3-HP序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-VP1-VP3-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-VP1-VP3-HP载体，回收长度为2.7kb的VP1-VP3-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-VP1-VP3（图10）。最后，我们构建了两种包装外壳突变AAV载体的AAV外壳突变质粒pAAV-R2C2-3YF（图12）、pAAV-R2C2-4YF（图13）。相比于pAAV-R2C2载体，pAAV-R2C2-3YF（图12）载体表达产生的AAV外壳（VP1、VP2和VP3）表面特定位置的酪氨酸突变为苯丙氨酸，具体为VP1序列中的第730位、第500位和第444位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F）及VP2和VP3序列中同VP1序列中第730位、第500位和第444位酪氨酸位置对应的酪氨酸突变为苯丙氨酸。同样，相比于pAAV-R2C2载体，pAAV-R2C2-4YF（图13）载体表达产生的AAV外壳（VP1、VP2和VP3）表面特定位置的酪氨酸也突变为苯丙氨酸，具体为VP1序列中的第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F）及VP2和VP3序列中同VP1序列中第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸位置对应的酪氨酸突变为苯丙氨酸。以AAVHelperFreeSystem中的pAAV-R2C2质粒（AgilentTechnologies，美国）为基础，参考文献（ZhongL，etal.ProcNatlAcadSciUSA.2008;10522:7827-7832.MowatFM，etal.GeneTher.2014;211:96-105.），将VP1蛋白中的第730位、第500位、第444位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F），得到的序列命名为Cap2-3YF，序列信息见SEQIDNO.12。将VP1蛋白中的第730位、第500位、第444位和第272位酪氨酸（Y）突变为苯丙氨酸（F），得到的序列命名为Cap2-4YF，序列信息见SEQIDNO.13。用Cap2-3YF序列或Cap2-4YF序列分别替换pAAV-R2C2质粒中Cap2编码序列，获得pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF质粒的序列信息。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF质粒中HindIII和PmeI酶切位点之间序列且包含HindIII和PmeI两个酶切位点，合成序列分别命名为Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP。Cap2-3YF-HP序列信息详见SEQIDNO.27，Cap2-4YF-HP序列信息详见SEQIDNO.28。将合成Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列分别克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-Cap2-3YF-HP或pUC57-1.8K-Cap2-4YF-HP载体。HindIII和PmeI双酶切消化pUC57-1.8K-Cap2-3YF-HP或pUC57-1.8K-Cap2-4YF-HP载体，回收长度为2.7kb的Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列片段备用。HindIII和PmeI双酶切消化pAAV-R2C2载体，回收长度为4.7kb的载体片段备用。将Cap2-3YF-HP或Cap2-4YF-HP序列片段分别同回收载体片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞（Takara，大连），挑取菌落，过夜培养，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到pAAV-R2C2-3YF（图12）或pAAV-R2C2-4YF（图13）载体。实施例2重组AAV病毒制备及检定参照文献（XiaoX,etal.JVirol.1998;723:2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pAAV-CMV-EGFP-COX10、pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B、pAAV-CMV-ND4-COX10、pAAV-CMV-ocND4-COX10或pscAAV-CAM-ocND4-ATP5B）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-DJ（用于包装AAVDJ病毒）、pAAV-R2C2、pAAV-R2C2-3YF或pAAV-R2C2-4YF）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B、scAAV24YF-ocND4-ATP5B等9重组病毒。参考文献（WarringtonKHJr，etal.JVirol.2004;7812:6595-6609.），应用四质粒包装系统包装重组AAV病毒scAAV2-HSP-mND4，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-HSP-mND4）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-VP2A-COX8-EGFP、pAAV-VP1-VP3）按照1:1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV2-HSP-mND4重组病毒。采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。其中，AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B等4种病毒定量PCR检测时采用针对EGFP序列的引物和探针。AAV2-ND4-COX10病毒采用针对ND4序列的引物和探针。AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B、scAAV24YF-ocND4-ATP5B采用针对ocND4序列的引物和探针。scAAV2-HSP-mND4病毒采用针对mND4序列的引物和探针。以AAVDJ-EGFP-COX10、scAAVDJ-EGFP-ATP5B、AAV2-EGFP-COX10、scAAV2-EGFP-ATP5B等4种病毒的定量PCR检测过程为例，示意操作过程。其他病毒的检测过程类似，只需要替换对应的检测引物、探针和质粒DNA标准品即可。具体过程如下：针对EGFP序列设计定量PCR检测用引物和探针：EGFP-Q-F：5’-CACATGAAGCAGCACGACTT-3’SEQIDNO.29EGFP-Q-R：5’-TCGCCCTTGAAGAAGATGGT-3’SEQIDNO.30EGFP-Q-P：5’-AGTCCGCCATGCCCGAAGGCT-3’SEQIDNO.31EGFP-Q-F和EGFP-Q-R为引物，EGFP-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerryquencher。引物和探针由ThermofisherScientific合成。以EGFP-Q-F和EGFP-Q-R为引物特异性地扩增EGFP序列中长度为80bp片段，采用TaqMan探针结合法，以108拷贝数μl的pAAV-CMV-EGFP-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用PremixExTaqProbeqPCR试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI7500fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见PremixExTaqProbeqPCR试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（AurnhammerC,etal.HumGeneTherMethods.2012;231:18-28.）。AAV2-ND4-COX10病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数μl的pAAV-CMV-ND4-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：ND4-Q-F：5’-CTAAAGCCCATGTCGAAGCC-3’SEQIDNO.32ND4-Q-R：5’-GAGGCGCATCATACCATAGC-3’SEQIDNO.33ND4-Q-P：5’-TGCGGCAAGTACCATTGACCCAGCG-3’SEQIDNO.34定量PCR检测时扩增片段大小为89bp。AAV2-ocND4-COX10、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B、scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数μl的pAAV-CMV-ocND4-COX10质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：ocND4-Q-F：5’-CTGAACATCCTGCTGCTGAC-3’SEQIDNO.35ocND4-Q-R：5’-ACCATGAAGGCCATGGTGTA-3’SEQIDNO.36ocND4-Q-P：5’-ACTGACCGCCCAGGAGCTGTCC-3’SEQIDNO.37定量PCR检测时扩增片段大小为95bp。scAAV2-HSP-mND4病毒定量PCR检测的标准品为108拷贝数μl的pscAAV-HSP-mND4质粒及其10倍梯度稀释的样品。针对ND4序列的定量PCR检测引物和探针：mND4-Q-F：5’-CCCACCTTGGCTATCATCAC-3’SEQIDNO.38mND4-Q-R：5’-TAGGAAGTATGTGCCTGCGT-3’SEQIDNO.39mND4-Q-P：5’-AGGCAACCAGCCAGAACGCCTGA-3’SEQIDNO.40定量PCR检测时扩增片段大小为69bp。实施例3携带EGFP报告基因AAV病毒体外细胞实验采用三质粒包装系统，将pAAV-CMV-EGFP-COX10和pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B。包装得到的AAVDJ-EGFP-COX10和scAAVDJ-EGFP-ATP5B病毒分别以1×105vgcell的剂量感染人BJ细胞（购自ATCC（AmericanTissueCultureCollection，美国组织培养库），ATCCNO.CRL-2522）。病毒转导细胞72h后，共聚焦显微镜（LeicaTSC4D）观察绿色荧光蛋白表达情况及在细胞中分布。用ATP合成酶α亚基定位细胞中线粒体。同一视野下，细胞内绿色荧光蛋白分布和ATP合成酶α亚基分布的重叠区域即为线粒体中绿色荧光蛋白的分布区域。检测操作过程参见文献（BonnetC，etal.RejuvenationRes.2007;102:127-144.）。检测结果如图14所示。从图14的结果可知，两种病毒都能够有效地转导人BJ细胞，且在细胞内表达绿色荧光蛋白。表达产生绿色荧光蛋白在细胞内的分布区域同ATP合成酶α亚基的分布区域一致，说明表达绿色荧光蛋白有效地定位于线粒体中，提示线粒体定位肽加上线粒体靶向mRNA序列策略可有效地将细胞核表达产生基因定位于线粒体中，使线粒体基因在细胞核中异位表达成为可能。实施例4玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B转导小鼠视网膜细胞实验采用三质粒包装系统，将pscAAV-CAM-EGFP-ATP5B质粒分别包装成scAAV2-EGFP-ATP5B。包装得到的scAAV2-EGFP-ATP5B病毒分别以2×109vg1μL只眼的剂量经玻璃体腔注射C57BL6J小鼠。注射病毒2周后，处死小鼠，分离小鼠视网膜，冰冻切片后，用细胞核染料DAPI处理标记细胞核，荧光显微镜下分别观察绿色荧光蛋白表达情况和DAPI染料结合情况。同一视野下两种观察情况下成像结果叠加，得到如图15所示的结果。从图15的结果可知，玻璃体腔注射scAAV2-EGFP-ATP5B病毒后，神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）细胞，内核细胞层（INL，innernuclearcell）细胞，视网膜色素上皮细胞层（RPE，retinalpigmentepithelium）细胞都检测到绿色荧光蛋白表达，其中GCL细胞绿色荧光蛋白表达强度最高，说明scAAV2-EGFP-ATP5B病毒经玻璃体腔注射后能够有效地转导神经节细胞。而外核细胞层（ONL，outernuclearlayer）细胞中几乎未检测到绿色荧光蛋白表达，说明scAAV2-EGFP-ATP5B病毒经玻璃体腔注射后对ONL细胞转导效率偏低。实施例5不同病毒组合注射C57BL6J小鼠实验包装得到scAAV2-HSP-mND4、AAV2-EGFP-COX10、AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10和scAAV2-ocND4-ATP5B等5种病毒。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射20只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只小鼠。4组小鼠分别经玻璃体腔注射AAV2-EGFP-COX10或AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10以及scAAV2-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅、图形视网膜电位延迟时间，用光学相干断层成像术（opticalcoherencetomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。检测操作过程参见文献（KoilkondaRD，etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.），检测结果如图16、图17和图18所示。其中图16为图形视网膜电位振幅检测结果，图17为图形视网膜电位延迟时间检测结果，图18为GCL和IPL细胞层厚度检测结果。从图16的检测结果可知，相比于未注射病毒C57BL6J小鼠（Control），先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜电位振幅显著降低，注射后3个不同的时间点（注射后2个月、6个月和12个月）呈现出相似的规律。这是因为scAAV2-HSP-mND4病毒转导视网膜神经节细胞后能够表达产生突变的ND4蛋白，而AAV2-EGFP-COX10病毒又不能表达产生正常的ND4蛋白，导致神经节细胞功能障碍，模拟ND4基因突变带来的生物学作用（KoilkondaRD，etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.）。相反先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则明显高于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅的大小关系为AAV2-ND4-COX10AAV2-ocND4-COX10scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。但只有再注射scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅能够恢复到接近未注射病毒野生型小鼠的水平。从图17的检测结果可知，相比于未注射病毒C57BL6J小鼠（Control），先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间增加，注射后3个不同的时间点（注射后2个月、6个月和12个月）呈现出相似的规律。这是因为scAAV2-HSP-mND4病毒转导视网膜神经节细胞后能够表达产生突变的ND4蛋白，而AAV2-EGFP-COX10病毒又不能表达产生正常的ND4蛋白，导致神经节细胞功能障碍，模拟ND4基因突变带来的生物学作用（KoilkondaRD，etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.）。相反先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间则明显短于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间的大小关系为AAV2-ND4-COX10AAV2-ocND4-COX10scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。但只有再注射scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间接近未注射病毒野生型小鼠的水平。从图18的检测结果可知，神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）和内丛状层（IPL，innerplexiformlayers）总厚度变化同病毒注射后时间关系明显。病毒注射2个月后，不同病毒组合注射小鼠组间的GCL和IPL总厚度未见明显差异；病毒注射6个月后，虽然注射病毒组的GCL和IPL总厚度低于未注射病毒对照组，但差异不明显；病毒注射12个月后，先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）和内丛状层（IPL，innerplexiformlayers）总厚度明显低于未注射病毒对照组小鼠以及其他3种病毒组合注射小鼠。可能的原因是GCL和IPL总厚度的变化需要时间，所以在观察初期（病毒注射2个月后和病毒注射6个月后）GCL和IPL总厚度变化不大，至病毒注射12个月后GCL和IPL总厚度观察到明显变化。病毒注射12个月后，先注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠等3种病毒组合注射小鼠的GCL和IPL总厚度明显大于先后注射scAAV2-HSP-mND4病毒和AAV2-ND4-COX10病毒小鼠，且再注射AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B病毒小鼠的GCL和IPL总厚度的大小关系为AAV2-ND4-COX10AAV2-ocND4-COX10scAAV2-ocND4-ATP5B，提示ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因都能够提高病毒注射小鼠后的ND4基因表达效率。总之，以未注射病毒的C57BL6J小鼠为对照，4种不同的病毒组合分别注射C57BL6J小鼠。结果相比于未注射病毒C57BL6J小鼠，先后注射scAAV2-HSP-mND4和AAV2-EGFP-COX10病毒小鼠的图形视网膜振幅电位变小、图形视网膜电位延迟时间增加以及GCL和IPL总厚度减小。scAAV2-HSP-mND4病毒采用改造后的AAV外壳，病毒外壳中含有线粒体靶向定位肽，有助于AAV病毒进入细胞后进一步转运至线粒体中，释放出病毒携带基因组，在线粒体启动子（HSP）的调控下，表达产生突变的ND4蛋白，造成视网膜中神经节细胞的损伤，形成LHON小鼠模型（KoilkondaRD，etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.）。AAV2-EGFP-COX10病毒表达产生EGFP蛋白，不表达产生ND4蛋白，故无法恢复突变ND4（mND4）蛋白对视网膜神经节细胞的损伤，导致各种LHON病理特征的出现。相反注射scAAV2-HSP-mND4病毒后，再注射表达正常ND4蛋白的病毒（AAV2-ND4-COX10、AAV2-ocND4-COX10或scAAV2-ocND4-ATP5B）可在不同程度上缓解或恢复注射scAAV2-HSP-mND4病毒带来的生理变化，提示用AAV载体携带正常ND4蛋白表达框转导视网膜细胞可有效地治疗LHON，具有开发成为LHON基因治疗药物的潜力。而且ND4编码基因人源化表达优化、双链AAV载体携带优化后的人源化表达ND4基因等方式基因治疗药物结构设计可以提升药物的治疗效果。实施例6不同AAV外壳对于设计LHON基因药物有效性影响实验本实验着眼于比较不同AAV外壳对LHON基因药物的有效性的影响。包装得到scAAV2-HSP-mND4、scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B等4种病毒。scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B等3种病毒携带相同的人源化表达优化的ND4表达框，为3种不同的AAV载体外壳病毒。scAAV2-ocND4-ATP5B为双链AAV2病毒，scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B为外壳改造后的双链AAV2病毒，具体的改造过程详见实施例1和实施例2。将scAAV2-HSP-mND4病毒经玻璃体腔注射至C57BL6J小鼠眼球中，注射剂量为2×109vg1μL只眼，共注射15只小鼠。注射scAAV2-HSP-mND4病毒72h后，将15只小鼠随机分为3组，每组5只小鼠。3组小鼠分别经玻璃体腔注射scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B或scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒，注射剂量为2×109vg1μL只眼。以未注射病毒的正常C57BL6J小鼠为对照，注射病毒2个月、6个月和12个月后，分别记录图形视网膜电位振幅、图形视网膜电位延迟时间，用光学相干断层成像术（opticalcoherencetomography，OCT）检测视网膜中GCL和IPL细胞层厚度。检测操作过程参见文献（KoilkondaRD，etal.ArchOphthalmol.2010;1287:876-883.），检测结果如图19、图20和图21所示。其中图19为图形视网膜电位振幅检测结果，图20为图形视网膜电位延迟时间检测结果，图21为GCL和IPL细胞层厚度检测结果。从图19的检测结果可知，3种不同外壳的AAV病毒（scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B）对小鼠图形视网膜电位振幅恢复程度存在差异，注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅仍低于未注射病毒的C57BL6J小鼠，而注射scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则高于未注射病毒的C57BL6J小鼠，提示3种不同外壳的AAV病毒可能会影响药物的有效性。从图20的检测结果可知，3种不同外壳的AAV病毒（scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B）对小鼠图形视网膜电位延迟时间的影响也存在差异，注射scAAV2-ocND4-ATP5B或scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位延迟时间仍长于未注射病毒的C57BL6J小鼠，而注射scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的图形视网膜电位振幅则短于未注射病毒的C57BL6J小鼠，再次提示3种不同外壳的AAV病毒可能会影响药物的有效性。从图21的检测结果可知，神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）和内丛状层（IPL，innerplexiformlayers）总厚度变化同病毒注射后时间关系明显。病毒注射2个月后，不同病毒组合注射小鼠组间的GCL和IPL总厚度未见明显差异；病毒注射6个月后，虽然注射病毒组的GCL和IPL总厚度低于未注射病毒对照组，但差异不明显；病毒注射12个月后，注射scAAV2-ocND4-ATP5B、scAAV23YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）和内丛状层（IPL，innerplexiformlayers）总厚度低于未注射病毒对照组小鼠，而注射scAAV24YF-ocND4-ATP5B病毒小鼠的神经节细胞层（GCL，ganglioncelllayer）和内丛状层（IPL，innerplexiformlayers）总厚度则同未注射病毒对照组小鼠差异不大。再次证明AAV外壳可能影响LHON基因药物的有效性。总之，以未注射病毒的C57BL6J小鼠为对照，3种不同的病毒组合分别注射C57BL6J小鼠，比较分析了3种不同的AAV外壳对LHON药物有效性的影响。结果发现相比于天然的AAV2外壳，改造后的AAV2外壳AAV2AAV23YF和AAV24YF携带ND4蛋白表达框（scAAV23YF-ocND4-ATP5B和scAAV24YF-ocND4-ATP5B）表现出更好的有效性，具体为注射小鼠后的图形视网膜振幅电位恢复更好、图形视网膜电位延迟时间增加更少以及GCL和IPL总厚度减少程度更低，而且scAAV24YF-ocND4-ATP5B的效果优于scAAV23YF-ocND4-ATP5B。序列表110北京五加和分子医学研究所有限公司120Leber遗传性视神经病变的基因药物16040170SIPOSequenceListing1.02102211600212DNA213人工序列ArtificialSequence4002attgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacg60tcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatat120gccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgccca180gtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat240tacccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccc300cacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggg360gggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggc420ggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcga480ggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgacgcgtgtaagtt540ggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattaccttttttacag600210321184212DNA213人工序列ArtificialSequence4003atggccgcatctccgcacactctctcctcacgcctcctgacaggttgcgtaggaggctct60gtctggtatcttgaaagaagaact8421032111431212DNA213人工序列ArtificialSequence4003cgagcactgggacgcccaccgcccctttccctccgctgccaggcgagcatgttgtggtaa60ttctggaacacaagaagagaaattgctgggtttagaacaagattataaacgaattcggtg120ctcagtgatcacttgacagttttttttttttttaaatattacccaaaatgctccccaaat180aagaaatgcatcagctcagtcagtgaatacaaaaaaggaattatttttccctttgagggt240cttttatacatctctcctccaaccccaccctctattctgtttcttcctcctcacatgggg300gtacacatacacagcttcctcttttggttccatccttaccaccacaccacacgcacactc360cacatgcccagcagagtggcacttggtggccagaaagtgtgagcctcatgatctgctgtc420tgtagttctgtgagctcaggtccctcaaaggcctcggagcacccccttccttgtgactga480gccagggcctgcatttttggttttccccaccccacacattctcaaccatagtccttctaa540caataccaatagctaggacccggctgctgtgcactgggactggggattccacatgtttgc600cttgggagtctcaagctggactgccagcccctgtcctcccttcacccccattgcgtatga660gcatttcagaactccaaggagtcacaggcatctttatagttcacgttaacatatagacac720tgttggaagcagttccttctaaaagggtagccctggacttaataccagccggatacctct780ggcccccaccccattactgtacctctggagtcactactgtgggtcgccactcctctgcta840cacagcacggctttttcaaggctgtattgagaagggaagttaggaagaagggtgtgctgg900gctaaccagcccacagagctcacattcctgtcccttgggtgaaaaatacatgtccatcct960gatatctcctgaattcagaaattagcctccacatgtgcaatggctttaagagccagaagc1020agggttctgggaattttgcaagttacctgtggccaggtgtggtctcggttaccaaatacg1080gttacctgcagctttttagtcctttgtgctcccacgggtctacagagtcccatctgccca1140aaggtcttgaagcttgacaggatgttttcgattactcagtctcccagggcactactggtc1200cgtaggattcgattggtcggggtaggagagttaaacaacatttaaacagagttctctcaa1260aaatgtctaaagggattgtaggtagataacatccaatcactgtttgcacttatctgaaat1320cttccctcttggctgcccccaggtatttactgtggagaacattgcataggaatgtctgga1380aaaagcttctacaacttgttacagccttcacatttgtagaagctttggatc14312104211145212DNA213人工序列ArtificialSequence4004ggggtctttgtcctctgtactgtctctctccttgcccctaacccaaaaagcttcattttt60ctgtgtaggctgcacaagagccttgattgaagatatattctttctgaacagtatttaagg120tttccaataaaatgtacacccctca14521052111464212DNA213人工序列ArtificialSequence4005atggccgcatctccgcacactctctcctcacgcctcctgacaggttgcgtaggaggctct60gtctggtatcttgaaagaagaactatgctaaaactaatcgtcccaacaattatgttacta120ccactgacatggctttccaaaaaacacatgatttggatcaacacaaccacccacagccta180attattagcatcatccctctactattttttaaccaaatcaacaacaacctatttagctgt240tccccaaccttttcctccgaccccctaacaacccccctcctaatgctaactacctggctc300ctacccctcacaatcatggcaagccaacgccacttatccagtgaaccactatcacgaaaa360aaactctacctctctatgctaatctccctacaaatctccttaattatgacattcacagcc420acagaactaatcatgttttatatcttcttcgaaaccacacttatccccaccttggctatc480atcacccgatggggcaaccagccagaacgcctgaacgcaggcacatacttcctattctac540accctagtaggctcccttcccctactcatcgcactaatttacactcacaacaccctaggc600tcactaaacattctactactcactctcactgcccaagaactatcaaactcctgggccaac660aacttaatgtggctagcttacacaatggcttttatggtaaagatgcctctttacggactc720cacttatggctccctaaagcccatgtcgaagcccccatcgctgggtcaatggtacttgcc780gcagtactcttaaaactaggcggctatggtatgatgcgcctcacactcattctcaacccc840ctgacaaaacacatggcctaccccttccttgtactatccctatggggcatgattatgaca900agctccatctgcctacgacaaacagacctaaaatcgctcattgcatactcttcaatcagc960cacatggccctcgtagtaacagccattctcatccaaaccccctggagcttcaccggcgca1020gtcattctcatgatcgcccacgggcttacatcctcattactattctgcctagcaaactca1080aactacgaacgcactcacagtcgcatcatgatcctctctcaaggacttcaaactctactc1140ccactaatggctttttggtggcttctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccact1200attaacctactgggagaactctctgtgctagtaaccacgttctcctggtcaaatatcact1260ctcctacttacaggactcaacatgctagtcacagccctatactccctctacatgtttacc1320acaacacaatggggctcactcacccaccacattaacaacatgaaaccctcattcacacga1380gaaaacaccctcatgttcatgcacctatcccccattctcctcctatccctcaaccccgac1440atcattaccgggttttcctcttga146421062111464212DNA213人工序列ArtificialSequence4006atggccgccagccctcacacactgagctccaggctgctgaccggatgcgtgggaggcagc60gtgtggtatctggagcggagaaccatgctgaagctgatcgtgcctacaatcatgctgctg120ccactgacctggctgagcaagaagcacatgatctggatcaataccacaacccactctctg180atcatcagcatcatccctctgctgttctttaaccagatcaacaataacctgttctcttgt240agcccaacattttctagcgacccactgacaacccccctgctgatgctgacaacctggctg300ctgccactgaccatcatggcctcccagaggcacctgtcctctgagcccctgtctcgcaag360aagctgtacctgtccatgctgatctctctgcagatcagcctgatcatgaccttcacagcc420accgagctgatcatgttctacatcttctttgagacaaccctgatccccacactggccatc480atcacccggtggggcaatcagcctgagagactgaacgccggcacatacttcctgttttat540accctggtgggctctctgccactgctgatcgccctgatctatacacacaataccctgggc600agcctgaacatcctgctgctgacactgaccgcccaggagctgtccaattcttgggccaat660aacctgatgtggctggcctacaccatggccttcatggtgaagatgcccctgtatggactg720cacctgtggctgccaaaggcacacgtggaggcacctatcgcaggcagcatggtgctggca780gccgtgctgctgaagctgggaggctacggcatgatgcggctgacactgatcctgaaccca840ctgaccaagcacatggcctatccctttctggtgctgtccctgtggggcatgatcatgaca900agctccatctgcctgagacagaccgacctgaagtctctgatcgcctactctagcatcagc960cacatggccctggtggtgacagccatcctgatccagacaccctggagcttcaccggcgcc1020gtgatcctgatgatcgcccacggcctgacctcctctctgctgttttgtctggccaattcc1080aactatgagaggacacactcccgcatcatgatcctgtctcagggcctgcagaccctgctg1140cctctgatggcattctggtggctgctggcctccctggcaaatctggccctgccacctacc1200atcaacctgctgggcgagctgtctgtgctggtgacaaccttcagctggtccaatatcaca1260ctgctgctgaccggcctgaacatgctggtgacagccctgtacagcctgtatatgtttaca1320accacacagtggggctccctgacccaccacatcaataacatgaagccctctttcacacgg1380gagaataccctgatgtttatgcacctgagccctatcctgctgctgtccctgaacccagat1440atcatcaccggctttagctcctga1464210721138212DNA213人工序列ArtificialSequence4007taaccccataccccgaaccaaccaaaccccaaagacac3821082111378212DNA213人工序列ArtificialSequence4008atgctaaaactaatcgtcccaacaattatattactaccactgacatgactttccaaaaaa60cacataatttgaatcaacacaaccacccacagcctaattattagcatcatccctctacta120ttttttaaccaaatcaacaacaacctatttagctgttccccaaccttttcctccgacccc180ctaacaacccccctcctaatactaactacctgactcctacccctcacaatcatggcaagc240caacgccacttatccagtgaaccactatcacgaaaaaaactctacctctctatactaatc300tccctacaaatctccttaattataacattcacagccacagaactaatcatattttatatc360ttcttcgaaaccacacttatccccaccttggctatcatcacccgatgaggcaaccagcca420gaacgcctgaacgcaggcacatacttcctattctacaccctagtaggctcccttccccta480ctcatcgcactaatttacactcacaacaccctaggctcactaaacattctactactcact540ctcactgcccaagaactatcaaactcctgagccaacaacttaatatgactagcttacaca600atagcttttatagtaaagatacctctttacggactccacttatgactccctaaagcccat660gtcgaagcccccatcgctgggtcaatagtacttgccgcagtactcttaaaactaggcggc720tatggtataatacgcctcacactcattctcaaccccctgacaaaacacatagcctacccc780ttccttgtactatccctatggggcataattataacaagctccatctgcctacgacaaaca840gacctaaaatcgctcattgcatactcttcaatcagccacatagccctcgtagtaacagcc900attctcatccaaaccccctgaagcttcaccggcgcagtcattctcataatcgcccacggg960cttacatcctcattactattctgcctagcaaactcaaactacgaacgcactcacagtcac1020atcataatcctctctcaaggacttcaaactctactcccactaatagctttttgatgactt1080ctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccactattaacctactgggagaactctct1140gtgctagtaaccacgttctcctgatcaaatatcactctcctacttacaggactcaacata1200ctagtcacagccctatactccctctacatatttaccacaacacaatggggctcactcacc1260caccacattaacaacataaaaccctcattcacacgagaaaacaccctcatgttcatacac1320ctatcccccattctcctcctatccctcaaccccgacatcattaccgggttttcctctt13782109211788212DNA213人工序列ArtificialSequence4009atgtccgtcctgacgccgctgctgctgcggggcttgacaggctcggcccggcggctccca60gtgccgcgcgccaagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctgg120tcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcg180atgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgc240cctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccg300accacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagc360gcaccatcttcttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagg420gcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaaca480tcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgaca540agcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcg600tgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgc660ccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcg720atcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagc780tgtacaag788210102112208212DNA213人工序列ArtificialSequence40010atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaaggcggctccg420ggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccgga480aaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagac540tcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaact600aatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacgga660gtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatc720accaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatt780tccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttggggg840tattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatc900aacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtc960aaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggtt1020caggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaagga1080tgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctg1140aacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttct1200cagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttc1260cacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccag1320tacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggctt1380cagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctgga1440ccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatac1500tcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggc1560ccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctc1620atctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattaca1680gacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatct1740accaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgtt1800cttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaag1860attccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaa1920caccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccacc1980ttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtg2040gagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtac2100acttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtat2160tcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa2208210112112208212DNA213人工序列ArtificialSequence40011atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccg420ggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccgga480aaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagac540tcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaact600aatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacgga660gtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatc720accaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatt780tccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttggggg840tattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatc900aacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtc960aaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggtt1020caggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaagga1080tgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctg1140aacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttct1200cagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttc1260cacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccag1320tacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggctt1380cagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctgga1440ccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatac1500tcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggc1560ccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctc1620atctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattaca1680gacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatct1740accaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgtt1800cttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaag1860attccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaa1920caccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccacc1980ttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtg2040gagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtac2100acttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtat2160tcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa2208210122112208212DNA213人工序列ArtificialSequence40012atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccg420ggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccgga480aaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagac540tcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaact600aatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacgga660gtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatc720accaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatt780tccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttggggg840tattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatc900aacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtc960aaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggtt1020caggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaagga1080tgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctg1140aacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttct1200cagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttc1260cacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccag1320tacctgtattttttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggctt1380cagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctgga1440ccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaattt1500tcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggc1560ccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctc1620atctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattaca1680gacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatct1740accaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgtt1800cttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaag1860attccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaa1920caccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccacc1980ttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtg2040gagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtac2100acttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtat2160tcagagcctcgccccattggcaccagatttctgactcgtaatctgtaa2208210132112208212DNA213人工序列ArtificialSequence40013atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccg420ggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccgga480aaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagac540tcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaact600aatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacgga660gtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatc720accaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatt780tccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcacttttttggctacagcaccccttggggg840tattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatc900aacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtc960aaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggtt1020caggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaagga1080tgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctg1140aacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttct1200cagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttc1260cacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccag1320tacctgtattttttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggctt1380cagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctgga1440ccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaattt1500tcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggc1560ccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctc1620atctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattaca1680gacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatct1740accaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgtt1800cttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaag1860attccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaa1920caccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccacc1980ttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtg2040gagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtac2100acttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtat2160tcagagcctcgccccattggcaccagatttctgactcgtaatctgtaa220821014211720212DNA213人工序列ArtificialSequence40014atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720210152112235212DNA213人工序列ArtificialSequence40015atggccgccagccctcacacactgagctccaggctgctgaccggatgcgtgggaggcagc60gtgtggtatctggagcggagaaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtg120gtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggc180gagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggc240aagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttc300agccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggc360tacgtccaggagcgcaccatcttcttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgag420gtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaag480gaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctat540atcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatc600gaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggc660cccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagacccc720aacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctc780ggcatggacgagctgtacaagtaagtcgacgagcactgggacgcccaccgcccctttccc840tccgctgccaggcgagcatgttgtggtaattctggaacacaagaagagaaattgctgggt900ttagaacaagattataaacgaattcggtgctcagtgatcacttgacagtttttttttttt960ttaaatattacccaaaatgctccccaaataagaaatgcatcagctcagtcagtgaataca1020aaaaaggaattatttttccctttgagggtcttttatacatctctcctccaaccccaccct1080ctattctgtttcttcctcctcacatgggggtacacatacacagcttcctcttttggttcc1140atccttaccaccacaccacacgcacactccacatgcccagcagagtggcacttggtggcc1200agaaagtgtgagcctcatgatctgctgtctgtagttctgtgagctcaggtccctcaaagg1260cctcggagcacccccttccttgtgactgagccagggcctgcatttttggttttccccacc1320ccacacattctcaaccatagtccttctaacaataccaatagctaggacccggctgctgtg1380cactgggactggggattccacatgtttgccttgggagtctcaagctggactgccagcccc1440tgtcctcccttcacccccattgcgtatgagcatttcagaactccaaggagtcacaggcat1500ctttatagttcacgttaacatatagacactgttggaagcagttccttctaaaagggtagc1560cctggacttaataccagccggatacctctggcccccaccccattactgtacctctggagt1620cactactgtgggtcgccactcctctgctacacagcacggctttttcaaggctgtattgag1680aagggaagttaggaagaagggtgtgctgggctaaccagcccacagagctcacattcctgt1740cccttgggtgaaaaatacatgtccatcctgatatctcctgaattcagaaattagcctcca1800catgtgcaatggctttaagagccagaagcagggttctgggaattttgcaagttacctgtg1860gccaggtgtggtctcggttaccaaatacggttacctgcagctttttagtcctttgtgctc1920ccacgggtctacagagtcccatctgcccaaaggtcttgaagcttgacaggatgttttcga1980ttactcagtctcccagggcactactggtccgtaggattcgattggtcggggtaggagagt2040taaacaacatttaaacagagttctctcaaaaatgtctaaagggattgtaggtagataaca2100tccaatcactgtttgcacttatctgaaatcttccctcttggctgcccccaggtatttact2160gtggagaacattgcataggaatgtctggaaaaagcttctacaacttgttacagccttcac2220atttgtagaagcttt2235210162112895212DNA213人工序列ArtificialSequence40016atggccgcatctccgcacactctctcctcacgcctcctgacaggttgcgtaggaggctct60gtctggtatcttgaaagaagaactatgctaaaactaatcgtcccaacaattatgttacta120ccactgacatggctttccaaaaaacacatgatttggatcaacacaaccacccacagccta180attattagcatcatccctctactattttttaaccaaatcaacaacaacctatttagctgt240tccccaaccttttcctccgaccccctaacaacccccctcctaatgctaactacctggctc300ctacccctcacaatcatggcaagccaacgccacttatccagtgaaccactatcacgaaaa360aaactctacctctctatgctaatctccctacaaatctccttaattatgacattcacagcc420acagaactaatcatgttttatatcttcttcgaaaccacacttatccccaccttggctatc480atcacccgatggggcaaccagccagaacgcctgaacgcaggcacatacttcctattctac540accctagtaggctcccttcccctactcatcgcactaatttacactcacaacaccctaggc600tcactaaacattctactactcactctcactgcccaagaactatcaaactcctgggccaac660aacttaatgtggctagcttacacaatggcttttatggtaaagatgcctctttacggactc720cacttatggctccctaaagcccatgtcgaagcccccatcgctgggtcaatggtacttgcc780gcagtactcttaaaactaggcggctatggtatgatgcgcctcacactcattctcaacccc840ctgacaaaacacatggcctaccccttccttgtactatccctatggggcatgattatgaca900agctccatctgcctacgacaaacagacctaaaatcgctcattgcatactcttcaatcagc960cacatggccctcgtagtaacagccattctcatccaaaccccctggagcttcaccggcgca1020gtcattctcatgatcgcccacgggcttacatcctcattactattctgcctagcaaactca1080aactacgaacgcactcacagtcgcatcatgatcctctctcaaggacttcaaactctactc1140ccactaatggctttttggtggcttctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccact1200attaacctactgggagaactctctgtgctagtaaccacgttctcctggtcaaatatcact1260ctcctacttacaggactcaacatgctagtcacagccctatactccctctacatgtttacc1320acaacacaatggggctcactcacccaccacattaacaacatgaaaccctcattcacacga1380gaaaacaccctcatgttcatgcacctatcccccattctcctcctatccctcaaccccgac1440atcattaccgggttttcctcttgagtcgacgagcactgggacgcccaccgcccctttccc1500tccgctgccaggcgagcatgttgtggtaattctggaacacaagaagagaaattgctgggt1560ttagaacaagattataaacgaattcggtgctcagtgatcacttgacagtttttttttttt1620ttaaatattacccaaaatgctccccaaataagaaatgcatcagctcagtcagtgaataca1680aaaaaggaattatttttccctttgagggtcttttatacatctctcctccaaccccaccct1740ctattctgtttcttcctcctcacatgggggtacacatacacagcttcctcttttggttcc1800atccttaccaccacaccacacgcacactccacatgcccagcagagtggcacttggtggcc1860agaaagtgtgagcctcatgatctgctgtctgtagttctgtgagctcaggtccctcaaagg1920cctcggagcacccccttccttgtgactgagccagggcctgcatttttggttttccccacc1980ccacacattctcaaccatagtccttctaacaataccaatagctaggacccggctgctgtg2040cactgggactggggattccacatgtttgccttgggagtctcaagctggactgccagcccc2100tgtcctcccttcacccccattgcgtatgagcatttcagaactccaaggagtcacaggcat2160ctttatagttcacgttaacatatagacactgttggaagcagttccttctaaaagggtagc2220cctggacttaataccagccggatacctctggcccccaccccattactgtacctctggagt2280cactactgtgggtcgccactcctctgctacacagcacggctttttcaaggctgtattgag2340aagggaagttaggaagaagggtgtgctgggctaaccagcccacagagctcacattcctgt2400cccttgggtgaaaaatacatgtccatcctgatatctcctgaattcagaaattagcctcca2460catgtgcaatggctttaagagccagaagcagggttctgggaattttgcaagttacctgtg2520gccaggtgtggtctcggttaccaaatacggttacctgcagctttttagtcctttgtgctc2580ccacgggtctacagagtcccatctgcccaaaggtcttgaagcttgacaggatgttttcga2640ttactcagtctcccagggcactactggtccgtaggattcgattggtcggggtaggagagt2700taaacaacatttaaacagagttctctcaaaaatgtctaaagggattgtaggtagataaca2760tccaatcactgtttgcacttatctgaaatcttccctcttggctgcccccaggtatttact2820gtggagaacattgcataggaatgtctggaaaaagcttctacaacttgttacagccttcac2880atttgtagaagcttt2895210172112898212DNA213人工序列ArtificialSequence40017atggccgccagccctcacacactgagctccaggctgctgaccggatgcgtgggaggcagc60gtgtggtatctggagcggagaaccatgctgaagctgatcgtgcctacaatcatgctgctg120ccactgacctggctgagcaagaagcacatgatctggatcaataccacaacccactctctg180atcatcagcatcatccctctgctgttctttaaccagatcaacaataacctgttctcttgt240agcccaacattttctagcgacccactgacaacccccctgctgatgctgacaacctggctg300ctgccactgaccatcatggcctcccagaggcacctgtcctctgagcccctgtctcgcaag360aagctgtacctgtccatgctgatctctctgcagatcagcctgatcatgaccttcacagcc420accgagctgatcatgttctacatcttctttgagacaaccctgatccccacactggccatc480atcacccggtggggcaatcagcctgagagactgaacgccggcacatacttcctgttttat540accctggtgggctctctgccactgctgatcgccctgatctatacacacaataccctgggc600agcctgaacatcctgctgctgacactgaccgcccaggagctgtccaattcttgggccaat660aacctgatgtggctggcctacaccatggccttcatggtgaagatgcccctgtatggactg720cacctgtggctgccaaaggcacacgtggaggcacctatcgcaggcagcatggtgctggca780gccgtgctgctgaagctgggaggctacggcatgatgcggctgacactgatcctgaaccca840ctgaccaagcacatggcctatccctttctggtgctgtccctgtggggcatgatcatgaca900agctccatctgcctgagacagaccgacctgaagtctctgatcgcctactctagcatcagc960cacatggccctggtggtgacagccatcctgatccagacaccctggagcttcaccggcgcc1020gtgatcctgatgatcgcccacggcctgacctcctctctgctgttttgtctggccaattcc1080aactatgagaggacacactcccgcatcatgatcctgtctcagggcctgcagaccctgctg1140cctctgatggcattctggtggctgctggcctccctggcaaatctggccctgccacctacc1200atcaacctgctgggcgagctgtctgtgctggtgacaaccttcagctggtccaatatcaca1260ctgctgctgaccggcctgaacatgctggtgacagccctgtacagcctgtatatgtttaca1320accacacagtggggctccctgacccaccacatcaataacatgaagccctctttcacacgg1380gagaataccctgatgtttatgcacctgagccctatcctgctgctgtccctgaacccagat1440atcatcaccggctttagctcctgataagtcgacgagcactgggacgcccaccgccccttt1500ccctccgctgccaggcgagcatgttgtggtaattctggaacacaagaagagaaattgctg1560ggtttagaacaagattataaacgaattcggtgctcagtgatcacttgacagttttttttt1620tttttaaatattacccaaaatgctccccaaataagaaatgcatcagctcagtcagtgaat1680acaaaaaaggaattatttttccctttgagggtcttttatacatctctcctccaaccccac1740cctctattctgtttcttcctcctcacatgggggtacacatacacagcttcctcttttggt1800tccatccttaccaccacaccacacgcacactccacatgcccagcagagtggcacttggtg1860gccagaaagtgtgagcctcatgatctgctgtctgtagttctgtgagctcaggtccctcaa1920aggcctcggagcacccccttccttgtgactgagccagggcctgcatttttggttttcccc1980accccacacattctcaaccatagtccttctaacaataccaatagctaggacccggctgct2040gtgcactgggactggggattccacatgtttgccttgggagtctcaagctggactgccagc2100ccctgtcctcccttcacccccattgcgtatgagcatttcagaactccaaggagtcacagg2160catctttatagttcacgttaacatatagacactgttggaagcagttccttctaaaagggt2220agccctggacttaataccagccggatacctctggcccccaccccattactgtacctctgg2280agtcactactgtgggtcgccactcctctgctacacagcacggctttttcaaggctgtatt2340gagaagggaagttaggaagaagggtgtgctgggctaaccagcccacagagctcacattcc2400tgtcccttgggtgaaaaatacatgtccatcctgatatctcctgaattcagaaattagcct2460ccacatgtgcaatggctttaagagccagaagcagggttctgggaattttgcaagttacct2520gtggccaggtgtggtctcggttaccaaatacggttacctgcagctttttagtcctttgtg2580ctcccacgggtctacagagtcccatctgcccaaaggtcttgaagcttgacaggatgtttt2640cgattactcagtctcccagggcactactggtccgtaggattcgattggtcggggtaggag2700agttaaacaacatttaaacagagttctctcaaaaatgtctaaagggattgtaggtagata2760acatccaatcactgtttgcacttatctgaaatcttccctcttggctgcccccaggtattt2820actgtggagaacattgcataggaatgtctggaaaaagcttctacaacttgttacagcctt2880cacatttgtagaagcttt289821018211121212DNA213人工序列ArtificialSequence40018ccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgac60gcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggacagatcc120c12121019211865212DNA213人工序列ArtificialSequence40019ggatccgccccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaagg60tcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagg120gacagatccccaggaagctcctctgtgtcctcataaaccctaacctcctctacttgagag180gacattccaatcataggctgcccatccaccctctgtgtcctcctgttaattaggtcactt240aacaaaaaggaaattgggtaggggtttttcacagaccgctttctaagggtaattttaaaa300tatctgggaagtcccttccactgctgtgttccagaagtgttggtaaacagcccacaaatg360tcaacagcagaaacatacaagctgtcagctttgcacaagggcccaacaccctgctcatca420agaagcactgtggttgctgtgttagtaatgtgcaaaacaggaggcacattttccccacct480gtgtaggttccaaaatatctagtgttttcatttttacttggatcaggaacccagcactcc540actggataagcattatccttatccaaaacagccttgtggtcagtgttcatctgctgactg600tcaactgtagcattttttggggttacagtttgagcaggatatttggtcctgtagtttgct660aacacaccctgcagctccaaaggttccccaccaacagcaaaaaaatgaaaatttgaccct720tgaatgggttttccagcaccattttcatgagttttttgtgtccctgaatgcaagtttaac780atagcagttaccccaataacctcagttttaacagtaacagcttcccacatcaaaatattt840ccacaggttaagtcctcatttaaat86521020211956212DNA213人工序列ArtificialSequence40020atggccgccagccctcacacactgagctccaggctgctgaccggatgcgtgggaggcagc60gtgtggtatctggagcggagaaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtg120gtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggc180gagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggc240aagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttc300agccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggc360tacgtccaggagcgcaccatcttcttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgag420gtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaag480gaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctat540atcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatc600gaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggc660cccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagacccc720aacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctc780ggcatggacgagctgtacaagtaatgtcgacggggtctttgtcctctgtactgtctctct840ccttgcccctaacccaaaaagcttcatttttctgtgtaggctgcacaagagccttgattg900aagatatattctttctgaacagtatttaaggtttccaataaaatgtacacccctca956210212111618212DNA213人工序列ArtificialSequence40021atggccgccagccctcacacactgagctccaggctgctgaccggatgcgtgggaggcagc60gtgtggtatctggagcggagaaccatgctgaagctgatcgtgcctacaatcatgctgctg120ccactgacctggctgagcaagaagcacatgatctggatcaataccacaacccactctctg180atcatcagcatcatccctctgctgttctttaaccagatcaacaataacctgttctcttgt240agcccaacattttctagcgacccactgacaacccccctgctgatgctgacaacctggctg300ctgccactgaccatcatggcctcccagaggcacctgtcctctgagcccctgtctcgcaag360aagctgtacctgtccatgctgatctctctgcagatcagcctgatcatgaccttcacagcc420accgagctgatcatgttctacatcttctttgagacaaccctgatccccacactggccatc480atcacccggtggggcaatcagcctgagagactgaacgccggcacatacttcctgttttat540accctggtgggctctctgccactgctgatcgccctgatctatacacacaataccctgggc600agcctgaacatcctgctgctgacactgaccgcccaggagctgtccaattcttgggccaat660aacctgatgtggctggcctacaccatggccttcatggtgaagatgcccctgtatggactg720cacctgtggctgccaaaggcacacgtggaggcacctatcgcaggcagcatggtgctggca780gccgtgctgctgaagctgggaggctacggcatgatgcggctgacactgatcctgaaccca840ctgaccaagcacatggcctatccctttctggtgctgtccctgtggggcatgatcatgaca900agctccatctgcctgagacagaccgacctgaagtctctgatcgcctactctagcatcagc960cacatggccctggtggtgacagccatcctgatccagacaccctggagcttcaccggcgcc1020gtgatcctgatgatcgcccacggcctgacctcctctctgctgttttgtctggccaattcc1080aactatgagaggacacactcccgcatcatgatcctgtctcagggcctgcagaccctgctg1140cctctgatggcattctggtggctgctggcctccctggcaaatctggccctgccacctacc1200atcaacctgctgggcgagctgtctgtgctggtgacaaccttcagctggtccaatatcaca1260ctgctgctgaccggcctgaacatgctggtgacagccctgtacagcctgtatatgtttaca1320accacacagtggggctccctgacccaccacatcaataacatgaagccctctttcacacgg1380gagaataccctgatgtttatgcacctgagccctatcctgctgctgtccctgaacccagat1440atcatcaccggctttagctcctgataagtcgacggggtctttgtcctctgtactgtctct1500ctccttgcccctaacccaaaaagcttcatttttctgtgtaggctgcacaagagccttgat1560tgaagatatattctttctgaacagtatttaaggtttccaataaaatgtacacccctca1618210222111425212DNA213人工序列ArtificialSequence40022taaccccataccccgaaccaaccaaaccccaaagacacggtaccatgctaaaactaatcg60tcccaacaattatattactaccactgacatgactttccaaaaaacacataatttgaatca120acacaaccacccacagcctaattattagcatcatccctctactattttttaaccaaatca180acaacaacctatttagctgttccccaaccttttcctccgaccccctaacaacccccctcc240taatactaactacctgactcctacccctcacaatcatggcaagccaacgccacttatcca300gtgaaccactatcacgaaaaaaactctacctctctatactaatctccctacaaatctcct360taattataacattcacagccacagaactaatcatattttatatcttcttcgaaaccacac420ttatccccaccttggctatcatcacccgatgaggcaaccagccagaacgcctgaacgcag480gcacatacttcctattctacaccctagtaggctcccttcccctactcatcgcactaattt540acactcacaacaccctaggctcactaaacattctactactcactctcactgcccaagaac600tatcaaactcctgagccaacaacttaatatgactagcttacacaatagcttttatagtaa660agatacctctttacggactccacttatgactccctaaagcccatgtcgaagcccccatcg720ctgggtcaatagtacttgccgcagtactcttaaaactaggcggctatggtataatacgcc780tcacactcattctcaaccccctgacaaaacacatagcctaccccttccttgtactatccc840tatggggcataattataacaagctccatctgcctacgacaaacagacctaaaatcgctca900ttgcatactcttcaatcagccacatagccctcgtagtaacagccattctcatccaaaccc960cctgaagcttcaccggcgcagtcattctcataatcgcccacgggcttacatcctcattac1020tattctgcctagcaaactcaaactacgaacgcactcacagtcacatcataatcctctctc1080aaggacttcaaactctactcccactaatagctttttgatgacttctagcaagcctcgcta1140acctcgccttaccccccactattaacctactgggagaactctctgtgctagtaaccacgt1200tctcctgatcaaatatcactctcctacttacaggactcaacatactagtcacagccctat1260actccctctacatatttaccacaacacaatggggctcactcacccaccacattaacaaca1320taaaaccctcattcacacgagaaaacaccctcatgttcatacacctatcccccattctcc1380tcctatccctcaaccccgacatcattaccgggttttcctctttaa1425210232112205212DNA213人工序列ArtificialSequence40023ctggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaaggctccggga420aaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaag480gcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactca540gtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaat600acgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtg660ggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcacc720accagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttcc780agccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtat840tttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaac900aacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaa960gaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcag1020gtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgc1080ctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaac1140aacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcag1200atgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccac1260agcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtac1320ctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcag1380ttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccc1440tgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcg1500tggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccg1560gccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatc1620tttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagac1680gaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctacc1740aacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttctt1800ccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagatt1860ccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacac1920cctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttc1980agtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggag2040atcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacact2100tccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattca2160gagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa2205210242112993212DNA213人工序列ArtificialSequence40024ctggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagatgtccgtc420ctgacgccgctgctgctgcggggcttgacaggctcggcccggcggctcccagtgccgcgc480gccaagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctgg540acggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacct600acggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggccca660ccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatga720agcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatct780tcttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccc840tggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggc900acaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaaga960acggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcg1020ccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaacc1080actacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatgg1140tcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagg1200ctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaa1260ccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacg1320cagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgg1380gaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccg1440acggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagag1500tcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaac1560aaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcacccctt1620gggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagac1680tcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattc1740aagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagca1800cggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatc1860aaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctca1920ccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttc1980cttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttc2040ctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcg2100accagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaa2160ggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttc2220ctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtg2280aatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatc2340cgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcgggg2400ttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatga2460ttacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctg2520tatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaag2580gcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctggg2640caaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggac2700ttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcga2760ccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtca2820gcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattc2880agtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcg2940tgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa2993210252113454212DNA213人工序列ArtificialSequence40025aagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatga60atctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgct120tcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgttt180ctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgc240cagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaac300aataaatgatttaaatcaggtctggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggac360actctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaag420cccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctc480ggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctc540gagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtac600aaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaac660ctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgag720gaacctgttaagatgtccgtcctgacgccgctgctgctgcggggcttgacaggctcggcc780cggcggctcccagtgccgcgcgccaagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtgg840tgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcg900agggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggca960agctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttca1020gccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggct1080acgtccaggagcgcaccatcttcttcaagggcgacggcaactacaagacccgcgccgagg1140tgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaagg1200aggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctata1260tcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcg1320aggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggcc1380ccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagacccca1440acgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcg1500gcatggacgagctgtacaaggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtgg1560agccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattga1620attttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccac1680cagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatgg1740cagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgatt1800ccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacct1860acaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcact1920actttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccactttt1980caccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactca2040acttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacga2100ttgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgt2160acgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatgg2220tgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcat2280tttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttca2340gctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggacc2400gtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaa2460gtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcggg2520accagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacat2580ctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatg2640gcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaa2700agttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatg2760tggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtgg2820ctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagcta2880ccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgt2940accttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctc3000ccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccc3060cggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacac3120agtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagca3180aacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggact3240ttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctga3300ctcgtaatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaacttt3360ggtctctgcgtatttctttcttatctagtttccatggctacgtagataagtagcatggcg3420ggttaatcattaactacagcccgggcgtttaaac3454210262112669212DNA213人工序列ArtificialSequence40026aagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatga60atctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgct120tcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgttt180ctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgc240cagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaac300aataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggac360actctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaag420cccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctc480ggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctc540gagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtac600aaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaac660ctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgag720gaacctgttaaggcggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagcca780gactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaatttt840ggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagca900gccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagac960aataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccaca1020tggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaac1080aaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactacttt1140ggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcacca1200cgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttc1260aagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgcc1320aataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtc1380ctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgcca1440cagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttac1500tgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctac1560acttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctc1620atgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtgga1680accaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccag1740tctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcg1800gataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcaga1860gactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttt1920tttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggac1980attgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacg2040gagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgca2100gatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtacctt2160caggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctc2220atgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggta2280cctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtac2340tccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgc2400tggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttact2460gtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgt2520aatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtct2580ctgcgtatttctttcttatctagtttccatggctacgtagataagtagcatggcgggtta2640atcattaactacagcccgggcgtttaaac2669210272112669212DNA213人工序列ArtificialSequence40027aagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatga60atctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgct120tcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgttt180ctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgc240cagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaac300aataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggac360actctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaag420cccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctc480ggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctc540gagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtac600aaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaac660ctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgag720gaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagcca780gactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaatttt840ggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagca900gccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagac960aataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccaca1020tggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaac1080aaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactacttt1140ggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcacca1200cgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttc1260aagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgcc1320aataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtc1380ctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgcca1440cagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttac1500tgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctac1560acttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctc1620atgaatcctctcatcgaccagtacctgtattttttgagcagaacaaacactccaagtgga1680accaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccag1740tctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcg1800gataacaacaacagtgaattttcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcaga1860gactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttt1920tttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggac1980attgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacg2040gagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgca2100gatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtacctt2160caggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctc2220atgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggta2280cctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtac2340tccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgc2400tggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttact2460gtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatttctgactcgt2520aatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtct2580ctgcgtatttctttcttatctagtttccatggctacgtagataagtagcatggcgggtta2640atcattaactacagcccgggcgtttaaac2669210282112669212DNA213人工序列ArtificialSequence40028aagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatga60atctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgct120tcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgttt180ctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgc240cagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaac300aataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggac360actctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaag420cccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctc480ggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctc540gagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtac600aaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaac660ctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgag720gaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagcca780gactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaatttt840ggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagca900gccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagac960aataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccaca1020tggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaac1080aaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactttttt1140ggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcacca1200cgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttc1260aagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgcc1320aataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtc1380ctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgcca1440cagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttac1500tgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctac1560acttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctc1620atgaatcctctcatcgaccagtacctgtattttttgagcagaacaaacactccaagtgga1680accaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccag1740tctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcg1800gataacaacaacagtgaattttcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcaga1860gactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttt1920tttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggac1980attgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacg2040gagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgca2100gatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtacctt2160caggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctc2220atgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggta2280cctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtac2340tccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgc2400tggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttact2460gtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatttctgactcgt2520aatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtct2580ctgcgtatttctttcttatctagtttccatggctacgtagataagtagcatggcgggtta2640atcattaactacagcccgggcgtttaaac26692102921120212DNA213人工序列ArtificialSequence40029cacatgaagcagcacgactt202103021120212DNA213人工序列ArtificialSequence40030tcgcccttgaagaagatggt202103121121212DNA213人工序列ArtificialSequence40031agtccgccatgcccgaaggct212103221120212DNA213人工序列ArtificialSequence40032ctaaagcccatgtcgaagcc202103321120212DNA213人工序列ArtificialSequence40033gaggcgcatcataccatagc202103421125212DNA213人工序列ArtificialSequence40034tgcggcaagtaccattgacccagcg252103521120212DNA213人工序列ArtificialSequence40035ctgaacatcctgctgctgac202103621120212DNA213人工序列ArtificialSequence40036accatgaaggccatggtgta202103721122212DNA213人工序列ArtificialSequence40037actgaccgcccaggagctgtcc222103821120212DNA213人工序列ArtificialSequence40038cccaccttggctatcatcac202103921120212DNA213人工序列ArtificialSequence40039taggaagtatgtgcctgcgt202104021123212DNA213人工序列ArtificialSequence40040aggcaaccagccagaacgcctga23

权利要求：1.人线粒体ND4基因的细胞核表达框，其特征在于，（Ⅰ）包含细胞核启动子序列；（Ⅱ）含有线粒体定位肽编码序列和细胞核表达ND4基因编码区序列的融合序列；（III）线粒体表面锚定mRNA序列。2.如权利要求1所述的细胞核启动子序列，具体为人为设计的CAM启动子，序列信息见SEQIDNO.1。3.如权利要求1所述的融合序列，序列信息见SEQIDNO.6。4.如权利要求1所述的线粒体表面锚定mRNA序列，序列信息见SEQIDNO.4。5.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框或权利要求2、3、4要求序列的组合。6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体包括AAV2和AAV2外壳突变体。7.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体携带基因组DNA自身互补形成双链DNA分子。8.一种基因药物，其特征在于，包括权利要求1所述的基因表达框或权利要求2、3、4要求序列的组合以及权利要求5、6、7所述的重组腺相关病毒载体。9.权利要求8所述的基因药物，其特征在于，给药方式为玻璃体腔注射。10.权利要求8所述的基因药物，其特征在于，一次给药可持续表达产生靶向线粒体的ND4蛋白，有效缓解或治愈因ND4蛋白编码基因突变引起的Leber遗传性视神经病变。

百度查询： 北京锦篮基因科技有限公司 Leber遗传性视神经病变的基因药物