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申请/专利权人：卡德门企业有限公司

摘要：本发明涉及结合至VEGFR‑2的抗体。所述抗体用于治疗肿瘤性疾病、过度增殖性病症和血管生成病症，并且可以单独使用或者与其他药剂组合使用。

主权项：1.一种结合至人VEGFR2的分离抗体或其片段，其包含重链和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域含有CDR1H、CDR2H和CDR3H序列且其中所述轻链可变结构域含有CDR1L、CDR2L和CDR3L序列，其中：i所述CDR1H序列为GFTFSWYVMGSEQIDNO:237，ii所述CDR2H序列为SIYPQGGATSYADSVKGSEQIDNO:238，iii所述CDR3H序列为GNYFDYSEQIDNO:241，iv所述CDR1L序列为RASQSVSSNYFGSEQIDNO:245，v所述CDR2L序列为GASSRATSEQIDNO:246，和vi所述CDR3L序列为QQFDSLPLTSEQIDNO:247。

全文数据：人抗-VEGFR-2KDR抗体发明领域[0001]本发明涉及结合至VEGFR-2的抗体。所述抗体用于治疗肿瘤性疾病和过度增殖性病症，并且可以单独使用或者与其他药剂组合使用。[0002]相关申请的交叉引用[0003]本申请要求2014年10月7日提交的美国申请号62061，097的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文中。本申请还涉及2013年10月7日提交的PCTUS2013063754和2012年10月5日提交的美国序列号61710,420,两份申请均以引用的方式整体并入本文。[0004]发明背景[0005]血管生成是一种发展新血管的高度复杂的过程，它涉及毛细血管内皮细胞的增殖和迀移以及毛细血管内皮细胞从预先存在的血管中进行的组织浸润，细胞组装成管状结构，将新形成的管状组件连接至闭合的循环血管系统以及新形成的毛细血管的成熟。[0006]血管生成在正常生理过程中是重要的，所述正常生理过程包括胚胎发育、滤泡生长以及伤口愈合。过度血管生成也导致肿瘤性疾病和非肿瘤性疾病中的新生血管形成，所述非肿瘤性疾病诸如年龄相关性黄斑变性AMD、糖尿病性视网膜病和新生血管性青光眼。使用雷珠单抗ranibizumabLucentis®革巴向血管内皮生长因子VEGF的抗血管形成疗法已显示有效延迟AMD的进展。然而，新生血管形成是复杂的并且多种血管生成机制可能促成它。需要开发用于治疗与新生血管形成相关联的疾病的药剂和疗法。发明概要[0007]本发明提供结合至VEGFR-2KDR的人抗体及其片段。在一些实施方案中，抗体阻断配体（例如，VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E中的一种或多种）与VEGFR-2的结合。在一些实施方案中，所述抗体中和VEGFR-2的活化。所述抗体用于治疗肿瘤性疾病，包括例如实体瘤和非实体瘤以及过度增殖性病症。因此，本发明提供中和KDR的活化的方法、抑制肿瘤生长的方法包括抑制肿瘤相关性血管生成）以及治疗血管生成相关性病症的方法。本发明提供具有结合至VEGR受体的人抗体或抗体片段的试剂盒。[0008]在一个实施方案中，本发明提供一种结合至人VEGFR2的分离抗体或其片段，其包含含有⑶R1XDR2和⑶R3序列的重链可变结构域，其中：[0009]iCDRl序列为GFTFSWYVMGSEQIDN0:237，[0010]ii⑶R2序列选自由以下组成的组[0011]SIYPQGGATSYADSVKGSEQIDN0：238,[0012]SIYPQGGATNYADSVKGSEQIDN0:239以及[0013]SIYPSGGATNYADSVKGSEQIDN0:240;并且[0014]ii⑶R3序列选自由以下组成的组[0015]GNYFDYSEQIDNO:241，[0016]GNYLDYSEQIDNO:242，[0017]GPYLDYSEQIDNO:243以及[0018]GSYLDYSEQIDNO:244，[0019]条件是所述重链可变结构域并不包含SEQIDNO:240的CDR2序列和SEQIDNO:241的CDR3序列。[0020]在一个实施方案中，本发明提供一种结合至VEGFR2的分离抗体或其片段，其包含含有CDRl、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域，其中[0021]iCDRl序列为RASQSVSSNYFGSEQIDN0:245，[0022]iiCDR2序列为GASSRATSEQIDNO:246，并且[0023]iii⑶R3序列选自由以下组成的组[0024]QQFDSLPLTSEQIDN0：247,[0025]QQHDSSPLSSEQIDNO：248,[0026]QQFDSSPLSSEQIDN0:249以及[0027]QQFDSSPLTSEQIDN0:250。[0028]在本发明的一个实施方案中，重链可变结构域的CDR2具有序列SIYPQGGATSYADSVKGSEQIDN0:238，并且重链可变结构域的CDR3具有序列GNYFDYSEQIDNO：241〇[0029]在本发明的一个实施方案中，轻链可变结构域的CDR3具有序列QQFDSLPLTSEQIDNO：247〇[0030]在本发明的一个实施方案中，重链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列[0031]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：200,[0032]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMSWVRQAPGKGLEffVSSIYPQGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：208,[0033]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEffVSSIYPSGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYLDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：216,[0034]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEffVSSIYPSGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYLDYWGQGTLVTVSSSEQIDN0:224以及[0035]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEffVSSIYPSGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYLDYWGQGTLVTVSSSEQIDN0：232〇[0036]在本发明的一个实施方案中，轻链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列[0037]DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLPLTFGGGTKVEIKRSEQIDNO：204,[0038]DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQHDSSPLSFGGGTKVEIKRSEQIDNO：212,[0039]DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSSPLSFGGGTKVEIKRSEQIDNO：220,[0040]DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSSPLTFGGGTKVEIKRSEQIDN0:228以及[0041]DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSSPLTFGGGTKVEIKRSEQIDN0：236〇[0042]在本发明的一个实施方案中，重链可变结构域具有序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSSSEQIDN0:200，并且轻链可变结构域具有序列DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLPLTFGGGTKVEIKRSEQIDN0:204。[0043]在本发明的一个实施方案中，抗体或片段具有同种型IgG。[0044]在本发明的一个实施方案中，抗体或片段为80?¥、？¥413’、？13、？13’）2或双抗体。[0045]在本发明的一个实施方案中，抗体或片段结合至人VEGFR2和鼠hVEGFR2。[0046]本发明提供一种编码本发明的抗体或片段的分离的核酸。[0047]本发明提供一种包含编码本发明的抗体或片段的分离的核酸的核酸载体。[0048]本发明提供一种包含编码本发明的抗体或片段的分离的核酸的原核或真核宿主细胞。[0049]本发明提供一种包含本发明的抗体或片段和药学上可接受的载体的组合物。[0050]本发明提供一种中和人VEGFR2或鼠VEGFR2的活化的方法，其包括将细胞与有效量的本发明的抗体或片段接触。[0051]本发明提供一种抑制血管生成的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或片段。[0052]本发明提供一种减少肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或片段。[0053]本发明提供一种治疗受试者的肿瘤性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或片段，其中所述肿瘤性疾病选自由以下组成的组:肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌以及胰腺癌。[0054]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的表皮生长因子受体EGFR拮抗剂。[0055]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的fms-样酪氨酸激酶受体fit-i拮抗剂。[0050]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的rho相关性激酶2R0CK2拮抗剂。[0057]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的基质金属蛋白酶拮抗剂。[0058]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的PDGFRβ抗体。[0059]在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的ro-Ll抗体。[0060]在本发明的一个实施例中，所述患者为人。[0061]附图简述[0062]图IA-图IC分别示出了通过噬菌体展示鉴别的本发明的抗-VEGFR2抗体的人重链、λ轻链和κ轻链可变区序列。[0063]图2示出本发明的抗体与hVEGFR2顶部）和含有hVEGFR2的结构域2和3的构建体中部）的结合。底部图示出了配体VEGF165阻断。[0064]图3显示本发明的MablOl和Mabl02在过表达KDR人VEGFR2的猪主动脉血管内皮PAE细胞中抑制VEGFA刺激的VEGFR2、AKT和MPK的磷酸化。[0065]图4示出由Mab104、Mab105、Mab106和Mab108阻断的与hVEGFR2和VEGFi65配体的结合。在单独的实验中对于Mab103、107、109和110获得类似的结果。这些Mab含有MablOl的重链可变结构域，与不同轻链可变结构域重组。[0066]图5显示本发明的Mab105和106在过表达KDR人VEGFR2的猪主动脉血管内皮PAE细胞中抑制VEGFR2、AKT和MPK的VEGFA刺激的磷酸化。[0067]图6A描绘了衍生自Mabl38的五种亲和力成熟的抗体的重链氨基酸序列，其含有具有SEQIDN0:4的Vh结构域序列也示出在此图中）。图6B描绘了衍生自SEQIDN0:160的相同的五种亲和力成熟的抗体的轻链氨基酸序列也在此图中示出的序列）。[0068]图7A描绘了本发明的抗体与可溶性人和鼠VEGFR2的结合，相较于DClO1结合至鼠VEGFR2的鼠单克隆Ab和仅结合至人VEGFR2的对照抗体。Mab147结合至人和鼠VEGFR2。Mabl06结合至人VEGFR2，但不结合至鼠VEGFR2。图7B描绘了来自配体阻断实验的数据。Mab147阻断了人VEGF与人VEGFR2的结合和鼠VEGF与鼠VEGFR2的结合。Mab106阻断了人VEGF与人VEGFR2的结合，但并未阻断鼠VEGF与鼠VEGFR2的结合。[0069]图8A描绘了Mabl06和Mab147与HUVEC人脐静脉内皮细胞和过表达KDR的猪主动脉内皮PAE细胞KDR-PAE上的人VEGFR2的结合。图8B显示Mab147而非Mab106结合至MS1鼠内皮细胞上的VEGFR2。在图8A和图8B中，对照为结合至hVEGFR2而非mVEGFR2的抗体。[0070]图9示出了Mab106和Mab147对VEGFR2-介导的信号转导进行的抑制。Mab106和Mab147以剂量依赖性方式抑制了KDR-PAE图9A细胞和HUVEC图9B中的KDR和p4442的磷酸化。[0071]图IOA描绘了Mab106、Mab147和结合至hVEGFR2的对照抗体对KDR-PAE细胞的增殖的抑制。图IOB示出了诱导的细胞迀移的抑制。使用VEGF梯度50ngmlVEGF高）、100ngmlVEGF低））诱导KDR-PAE细胞的迀移。曲线图描绘了在0.6ygml、3ygml或15ygml的Mab106或Mab147抗体存在下的细胞计数。[0072]图11描绘了Mab147对KDR-PAE细胞的VEGF-诱导的迀移进行的抑制。[0073]图12A描绘了Mabl47对鼠EOMA细胞的VEGFR2-介导的信号转导进行的抑制。并且图12B显示FACS研究表明Mab147与对照抗体相比具有增加的与EOMA细胞的结合。[0074]详述[0075]在一方面，本发明提供新型VEGFR2抗体或采用此类抗体的抗原结合片段，它们有效抑制VEGFR2依赖性信号转导。如本文所用的，“抑制受体”意指减小和或灭活受体转导信号的内在激酶活性。VEGFR2抑制的可靠测定为受体磷酸化的还原。[0076]本发明并不限于任何特定的VEGFR2抑制机制。一种抗体所遵循的机制不必与另一种抗体所遵循的机制相同。一些可能的机制包括防止VEGF配体与VEGFR2的细胞外结合结构域的结合以及防止受体的二聚化或寡聚化。然而，可以排除其他机制。[0077]抗体为识别并结合至特异性抗原或物质的蛋白质。在优选的实施方案中，本发明的抗体至少像天然配体一样强地结合KDR。由抗原与抗体的解离的平衡常数0d表示的亲和力测量了抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力为抗体与其抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇与抗体上的抗原结合位点之间的亲和力以及每个抗体的结合位点的数目（化合价）。例如，单价抗体例如，Fab具有用于特定表位的一个结合位点。IgG抗体具有两个抗原结合位点。K解离常数Kd的倒数）的典型值为IO5至10nLmol。任何弱于l〇4Lmol的K被认为指示结合为非特异性的。[0078]本发明的抗体抑制VEGFR2的活化。VEGFR2抑制的一个量度为减小的受体酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶抑制可以使用已熟知的方法来测定，诸如测量受体的自身磷酸化水平。VEGFR2的抑制也可以通过抑制或调节天然或合成的VEGFR2底物或VEGFR2信号转导路径的其他组分的磷酸化事件来观察。磷酸化可以在ELISA测定中或在蛋白质印迹上例如使用对磷酸化特异的抗体检测。用于酪氨酸激酶活性的一些测定描述于Panek等，J·Pharmacol·Exp·Thera·，283:1433-441997和Batley等，LifeSci·，62:143-501998〇[0079]也可使用体内测定。例如，受体酪氨酸激酶抑制可以通过诱导有丝分裂测定在抑制剂存在和不存在下使用以受体配体刺激的细胞系来观察。例如，用VEGF刺激的HUVEC细胞ATCC可以用于测定VEGFR抑制。另一种方法涉及使用例如注射到小鼠中的人肿瘤细胞进行对表达VEGF的肿瘤细胞的生长抑制的测试。参见，美国专利号6,365,157Rockwell等）。[0080]本发明提供抗-VEGFR2抗体，包括编码此类抗体的核酸和包含此类抗体的组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体重链可变区，其包含⑶R-1H、CDR-2H和⑶R-3H序列，其中：[0081]iCDR-IH序列为GFTFSWYX1MX2SEQIDNO:185，其中Xi为V或I，X2为G或L，[0082]iiCDR-2H序列为SIXiX2SGGX3TX4YADSVKGSEQIDΝ0:186，其中Xi为Y或G，X2为P或S，X3为A或F，X4为N或D，并且[0083]iiiCDR-3H序列为GNYFDYSEQIDNO:3或GLAAPRSSEQIDNO:11。[0084]在一个实施方案中，本发明提供一种分离的轻链可变区，其包含⑶R-Ll、⑶R-L2和CDR-L3,其中[0085]iCDR-Ll序列为XiGX2X3LX4X5X6X7X8SSEQIDN0:187，其中Xi为S、Q或T，X2为D、E或Q，X3为K、S、N、I或A，X4为G或R，X5为D、S、H、E或N，X6为E、Y、Q、R或N，X7为Y、F或S，并且X8为A或S或SGSXiSNX2X3X4X5X6X7X8SEQIDN0:188，其中Xi为S或T，X2为I或UX3为E或G，X4为T、S或N，X5为N或Y，X6为T、P、A或Y，X7为V或L，并且X8为N、I或Y或X1GX2SX3DX4GX5YDYVSSEQIDN0:189，其中X^A或T，X2为S或T，X3为H、S或N，X4为I或V，并且X5为S或A，[0086]iiCDR-L2序列为XiX2X3X4X5PSSEQIDN0:190，其中Xi为Q、D、T、Y、S或Α，Χ2为D、N、S、T或V，X3为D、N、S、T或Y，X4为Q、K、N或L，并且X5为R或L，并且[0087]iii其中CDR-L3序列为QXiWX2X3X4X5X6X7X8SEQIDN0:191，其中Xi为A或T，X2为D或G，X3为R或无氨基酸，Χ4为S、F或Ν，Χ5为S、T或Ν，Χ6为S、T或Ρ，Χ7为A、V、L、I或Υ，并且X8为V或L或AXiTODX2LX3X4X5X6SEQID勵：192，其中父1为厶、5或1'，父2为~或5，父3为11或6，父4为6或s，x5为p、w或V，并且X6为V或L或Mystitx1LI^seqidno:193，其中X1Sa或τ。[0088]在一个实施方案中，本发明提供一种分离的轻链可变区，其包含⑶R-Ll、⑶R-L2和CDR-L3,其中[0089]iCDR-Ll序列为RASXiX2X3X4X5X6X7YX8X9SEQIDN0:194，其中Xi为Q、E或Η，Χ2为S、R或N，X3为V、I或L，X4为S、R、G或N，X5为S或N，X6为S、N、W或D，X7为G或无氨基酸，X8为L或F，并且X9为A、G、M或S，[0090]iiCDR-L2序列为GASXiRATSEQIDN0:195，其中Xi为S、T、I或N，并且[0091]iiiCDR-L3序列为QQXiX2X3X4X5X6X7X8SEQIDN0:196，其中Xi为F或Y，X2为D、G或Y，X3为S、T或N，X4为S、L或W，X5为P或无氨基酸，X6为P或T，X7为So[0092]在本发明的一个实施方案中，提供一种包含重链可变结构域的抗体，所述重链可变结构域包括一个、两个、三个、四个、五个或六个轻链可变结构域和上述重链可变结构域⑶R序列。[0093]提供VEGFR2-结合抗体序列的非限制性实例。如本文所述的，从人Fab噬菌体展示文库中，鉴别两种结合至人VEGFR2的中和抗体，阻断配体VEGFA与hVEGFR2的结合，并且抑制由VEGFA刺激的VEGFR2磷酸化和下游信号转导。表1指示抗体的抗体的CDR和可变结构域的氨基酸序列。Mab101和Mabl02的Kd分别为约6.6mM和1.7nM。[0094][0095]Mab101的重链使用κ轻链基因（K-文库）和λ轻链基因（λ-文库）改组。发现20种独特的λ轻链变体跨越针对人VEGFR2和小鼠VEGFR2的λ-文库。通过淘选针对人VEGFR2和小鼠VEGFR2的κ-文库发现22种独特的κ轻链变体。表2指示轻链的CDR和可变结构域的氨基酸序列。Mabl05、Mab106和Mab107的Kd增加约10倍（分别为0.24ηΜ、0.22ηΜ和0.12ηΜ。与亲本抗体一样，这些抗体结合至VEGFR2并且阻断VEGFA与VEGFR2的结合，并且抑制VEGFR2、ΑΚΤ和MPK的VEGFA刺激的磷酸化。（图4。[0096]几种抗体，包括Mab138、Mab139、Mab140和Mab146,也与小鼠VEGFR2交叉反应。这些抗体还抑制VEFGR2的VEGFA-刺激的磷酸化和下游信号转导分子包括MAPK。[0097][0098]本发明提供一种分离的VEGFR2抗体及其VEGFR2结合片段，它们包含选自表1和表2所列出的序列的一个、两个或三个重链CDR以及一个、两个或三个轻链CDR。在本发明的抗体中，当超过一个CDR选自表1和表2呈现的序列时，不同CDR不需要选自这些表中呈现的相同的单克隆抗体，但是可以选自这些表中呈现的两个或更多个抗体可变结构域。特定实施方案包括但不限于以下各项。在本发明的一实施方案中，分离的VEGFR2抗体包含一个、两个或三个具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的重链CDR。在本发明的一实施方案中，抗体包含一个、两个或三个具有SEQIDNO:5、SEQIDN0:6和SEQIDNO:7的轻链CDR。在另一个实施方案中，抗体包含一个、两个或三个具有如表1或表2所列出的序列的轻链CDR。非限制性实例包括轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQIDN0:25、SEQIDN0:26和SEQIDN0:27中的一个或多个;SEQIDN0:29、SEQIDN0:30和SEQIDN0:31中的一个或多个;或者SEQIDN0:33、SEQIDN0:34和SEQIDN0:35中的一个或多个。在某些实施方案中，VEGFR2抗体包含含有SEQIDN0:4或SEQIDNO:12的重链可变结构域。在其他实施方案中，VEGFR2抗体包含含有SEQIDNO:8、SEQIDNO:16、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31或SEQIDNO:35的轻链可变结构域。在某些实施方案中，抗体包含以上所提及的重链可变结构域之一和以上所提及的轻链可变结构域之一。在某些实施方案中，VEGFR2抗体或其结合片段包含一个或多个CDR或一个或多个可变结构域，它们具有与表1或2中所列出的CDR和可变结构域序列至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的抗体局域与本文所公开的那些序列和框架相同的CDR氨基酸，它们是至少85%、至少90%或至少95%相同的。[0099]“同一性”是指由两个氨基酸或核酸序列共享的相同位置的数目或百分比，考虑到为了最佳比对两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。“基本上相同的”意指不同之处仅在于保守性氨基酸取代，例如一种氨基酸对于另一种相同类别的取代例如，用缬氨酸取代甘氨酸、用精氨酸取代赖氨酸等），或者在于一个或多个非保守性取代、缺失或插入位于氨基酸序列的并不破坏蛋白质功能的位置处）的氨基酸序列。优选地，氨基酸序列与另一种氨基酸序列至少80%、更优选至少85%以及最优选至少90%类似。用于测定序列类似性的方法和计算机程序可公开获得，包括但不限于GCG程序包Devereux等，NucleicAcidsResearch12:387，1984、BLASTP、BLASTN、FASTAAltschul#，J.Mol.Biol.215:4031990以及ALIGN程序2.0版）。已熟知的SmithWaterman算法也可用于测定类似性。BLAST程序可从NCBI和其他来源公开获得BLASTManual,Altschul等，NCBINLMNIH，Bethesda，Md.20894;BLAST2.0,在http:www.ncbi.nlm.nih.govblast。在比较序列中，这些方法考虑了各种取代、缺失和其他修饰。保守性取代通常包括以下组内的取代:甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。[0100]本发明的抗体还包括已通过直接突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链改组来提高结合特征的那些抗体。亲和力和特异性可以通过使CDR突变并筛选具有所需特征的抗原结合位点来改变或改进。CDR以各种方式突变。一种方式是将单个残基或残基的组合随机分组，以使得在其他方面相同的抗原结合位点的群体中，所有二十种氨基酸可见于特定位置处。可选地，在一个范围的⑶R残基内通过易错PCR方法诱导突变参见，例如，Hawkins等，J.Mol.Biol.，226:889-8961992。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌突变株菌株中传代（参见，例如，Low等，J.Mol.Biol.，250:359-3681996。这些诱变方法解释了本领域技术人员已知的许多方法。[0101]为了使结合至VEGF受体的抗体的免疫原性最小化，本发明提供包含人可变结构域和恒定结构域序列的抗体。抗体可以是或者可以组合任何免疫球蛋白类别的成员，诸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE以及其子类。抗体类别可被选择来优化天然抗体的效应子功能（例如，补体依赖性细胞毒性CDC和抗体依赖性细胞毒性ADCC。[0102]本发明的某些实施方案涉及使用VEGFR2-结合抗体片段。Fv为含有完整重链和轻链可变结构域包含所有六个高变环CDR的最小片段。在缺乏恒定结构域的情况下，可变结构域为非共价缔合的。重链和轻链可使用接头连接成单一多肽链（“单链Fv”或“scFv”），所述接头允许Vh和I结构域缔合以形成抗原结合位点。在本发明的一个实施方案中，接头为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser3。由于scFv片段缺乏完整抗体的恒定结构域，所以它们适当小于完整抗体。scFv片段也不含正常重链恒定结构域与某些实施方案中可能不希望的其他生物分子的相互作用。[0103]也可以使用含有Vh、Vl以及任选地Cl、Ch1或其他恒定结构域的抗体片段。通过木瓜蛋白酶消化生成的单价抗体片段被称为Fab并且缺乏重链铰链区。通过胃蛋白酶消化生成的片段被称为Fab’）2,它保留了重链铰链并且是二价的。此类片段也可以重组产生。许多其他有用的抗原结合抗体片段为本领域已知的并且包括但不限于双抗体、三抗体、单结构域抗体以及其他单价和多价形式。[0104]本发明还提供了多价抗原结合蛋白，其可以呈（不限于抗体、其抗原结合片段以及包含抗体的所有或一部分抗原结合部分的蛋白质的形式。多价抗原结合蛋白可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。术语特异性是指特定分子可以结合的不同类型的抗原决定簇的数目。如果免疫球蛋白分子结合至仅一种类型的抗原决定簇，则所述免疫球蛋白分子为单特异性的。如果免疫球蛋白分子结合至不同类型的抗原决定簇，那么所述免疫球蛋白分子为多特异性的。[0105]例如，双特异性多价单链抗体允许识别两种不同类型的表位。两个表位可以是在相同抗原例如，VEGFR2上。可选地，一个表位可以是在抗原例如，VEGFR2上，并且第二个表位是在不同抗原上。[0106]在一个实施方案中，多价单链抗体包括连接至可变重链片段类似于scFv的可变轻链片段，所述可变重链片段通过另一个肽接头进一步连接到至少一个其他抗原结合结构域。通常，肽接头由约十五个氨基酸残基组成。在一个优选的实施方案中，Vl和Vh结构域的数目是相等的。例如，二价单链抗体可以表不如下:Ki-Vh-L2-Vl-L3-Vh或Vl-Li-Vh-L2-Vh-L3-Vl或Vh-L1-Vl-L2-Vh-L3-Vl或Vh-L1-Vl-L2-VL-L3-Vhi3三价或更大价的多价单链抗体具有通过另外的肽接头连接至二价单链抗体的一个或多个抗体片段。三价单链抗体的一个实例为：Vl_Li_V『L2_Vl_Li_V『L2_Vl_Li_Vh〇[0107]两个单链抗体可以组合来形成双抗体，其也称为二价二聚物。双抗体具有两条链。双抗体的每条链包含通过约5-10个氨基酸残基的短接头例如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser2连接至Vii吉构域的Vh结构域。此类接头足够短到能防止相同链上的结构域之间的链内配对，因此驱动了不同链上的互补结构域之间的链内配对并且重新形成两个抗原结合位点。双抗体结构是刚性和紧凑的，其中抗原结合位点是在分子的相反端处。双抗体可以是单特异性的或双特异性的。[0108]三个单链抗体可以组合来形成三抗体，其也称为三价三聚物。在一些实施方案中，三抗体使用直接融合至Vh或Vl结构域（即未使用任何接头序列）的氨基端的Vl或Vh结构域的羧基端来构造。三抗体具有三个Fv头部，其中多肽以环形的、从头至尾的方式排列。三抗体分子的可能的构象是平面的，其中三个结合位点以彼此呈120度角地位于平面中。三抗体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。[0109]可以理解的是，本发明的抗-VEGFR2抗体当出于预防或治疗目的用于哺乳动物时将以组合物的形式施用，所述组合物还包含药学上可接受的载体。适合的药学上可接受的载体包含例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种以及其组合。药学上可接受的载体还可以包含少量增强抗体的存放期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。[0110]在本发明的方法中，向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的抗体。如本文所用的术语“施用”意指通过可以实现所寻求的结果的任何方法向哺乳动物递送本发明的抗体。它们可以例如静脉内或肌肉内施用。尽管本发明的人抗体尤其适用于施用给人，但是它们也可以施用给其他哺乳动物。如本文所用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物以及农场动物。“治疗有效量”意指本发明的抗体当向哺乳动物施用时有效产生所需治疗效果，诸如抑制激酶活性的量。例如，根据疾病，对于抗体，这可能需要0.1、1.0、3.0、6.0或10.01^此。对于具有150,00^111〇1的分子质量的186两个结合位点），这些剂量对应于对于5L血液体积大约18nM、180nM、540nM、1.08μΜ以及1.8μΜ的结合位点。[0111]本发明的抗体适用于抑制肿瘤生长、与肿瘤生长相关的血管生成或与血管生成相关的其他病理学病状。可以治疗的肿瘤包括原发性肿瘤、转移性肿瘤和难治性肿瘤。难治性肿瘤包括不能响应于使用单独的化学治疗剂、单独的抗体、单独的辐射或其组合的治疗或者抵抗所述治疗的肿瘤。难治性肿瘤还包括似乎通过使用此类药剂的治疗得到抑制，但是在治疗停止后多至五年，有时多至十年或更长时间复发的肿瘤。抗体有效治疗血管化肿瘤和未血管化或基本上未血管化的肿瘤。[0112]因此可以治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤以及淋巴瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮样瘤、鳞状细胞肿瘤例如头颈部肿瘤）、结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤包括小细胞肺肿瘤和非小细胞肺肿瘤）、胰腺肿瘤、甲状腺瘤、卵巢肿瘤以及肝肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、恶性肿瘤、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤，肠胃和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤优选地多形性成胶质细胞瘤）以及平滑肌肉瘤。本发明的拮抗剂有效治疗的血管化皮肤癌的实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可以通过抑制恶性角化细胞诸如人恶性角化细胞的生长来治疗的皮肤癌。[0113]非实体瘤的实例包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性髓细胞性白血病AML、慢性髓细胞性白血病CML、急性淋巴细胞性白血病ALL、慢性淋巴细胞性白血病CLL、红细胞性白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些实例包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。[0114]本发明的抗体也可以用于治疗或预防特征在于过量血管生成的病理学病状，所述病状例如涉及血管化和或炎症，诸如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎RA、血管瘤、血管纤维瘤以及牛皮癣。非恶性肿瘤血管生成疾病的其他非限制性实例为早产儿视网膜病变（晶状体后纤维形成）、角膜移植排斥、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、Chron氏病、自身免疫性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、急性胰腺炎、同种异体移植排斥、过敏性炎症、接触性皮炎和迟发型超敏反应、炎症性肠病、败血性休克、骨质疏松、骨关节炎、由神经炎症诱导的认识缺陷、Osler-Weber综合征、再狭窄以及真菌、寄生虫和病毒感染包括巨细胞病毒（cytomegaloviral感染）。[0115]特征在于过量血管生成的眼部疾病包括青光眼、增殖性视网膜病包括增殖性糖尿病视网膜病变）以及黄斑变性本发明提供用于治疗眼部疾病和病症的方法和化合物。在一个实施方案中，本发明提供对以“干性”和“湿性”形式发生的年龄相关性黄斑病变AMD的治疗。AMD的“湿性”形式由于异常血管生长新生血管形成而引起视力丧失。来自这些视网膜血管的出血、渗漏和瘢痕最终引起对光感受器的不可逆的损害。干燥形式由视网膜色素上皮细胞层的萎缩引起，这在眼睛的中央部分中通过光感受器视杆和视锥的丧失来引起视力丧失。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗脉络膜新生血管形成CNV的方法。脉络膜新生血管形成是其中新血管在脉络膜中穿过布鲁赫膜；Bruchmembrane生长并侵入视网膜下空间的过程，并且在其他原因中是年龄相关性黄斑变性、近视和眼部创伤的症状。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗糖尿病黄斑水肿DME的方法。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗视网膜分支静脉阻塞（BRVO或视网膜中央静脉阻塞CRVO继发的黄斑水肿的方法。其他根据本发明可治疗的疾病包括但不限于虹膜新生血管形成、眼色素层炎、新生血管性青光眼以及早熟性视网膜炎ROP。治疗方法可以是预防性的，以便诸如在角膜移植之后避开角膜新生血管形成或者在小梁切除术中调节伤口愈合过程。[0116]本发明的抗体和抗原结合片段可以与第二药剂一起有利地施用给有需要的患者。例如，在一些实施方案中，本发明的VEGFR-2抗体与抗恶性肿瘤药剂一起施用给受试者。在一些实施方案中，VEGFR-2坑他与第二血管生成抑制剂一起施用给受试者。在一些实施方案中，本发明的VEGFR-2抗体与抗炎剂或免疫抑制剂一起施用。[0117]抗恶性肿瘤药剂包括细胞毒性化学治疗剂、靶向的小分子和生物分子以及辐射。化学治疗剂的非限制性实例包括顺铂、达卡巴嗪DTIC、更生霉素、依立替康、二氯甲基二乙胺氮芥）、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀BCNU、洛莫司汀CCNU、多柔比星（阿霉素）、道诺霉素、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、长春花碱、长春新碱、博莱霉素、紫杉醇紫杉酸）、多西他赛泰索帝）、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、光神霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌血生、普卡霉素、链脲菌素、三苯氧胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇以及其组合。[0118]靶向的小分子和生物分子包括但不限于信号转导路径的组分的抑制剂，诸如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂，以及结合至肿瘤特异性抗原的药剂。参与肿瘤发生的生长因子受体的非限制性实例为血小板源生长因子PDGFR、胰岛素样生长因子IGFR、神经生长因子NGFR和成纤维细胞生长因子FGFR的受体和表皮生长因子受体家族包括EGFRerbBl、HER2erbB2、erbB3以及erbB4的受体。[0119]EGFR拮抗剂包括结合至EGFR或结合至EGFR配体的抗体，并且抑制配体结合和或受体活化。例如，药剂可以阻断受体二聚物或与其他EGFR家族成员的异二聚物的形成。EGFR的配体包括例如EGF、TGF-a双调蛋白、肝素结合EGFHB-EGF以及betareculluliruEGFR拮抗剂可以在外部结合至EGFR的细胞外部分可以或不可以抑制配体的结合），或者在内部结合至酪氨酸激酶结构域。EGFR拮抗剂还包括例如通过抑制EGFR信号转导路径的组分的功能来抑制EGFR依赖性信号转导的药剂。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物分子，诸如对EGFR有特异性的抗体（以及其功能等效物）以及小分子，诸如直接作用于EGFR的细胞质结构域上的合成激酶抑制剂。[0120]小分子和生物抑制剂包括表皮生长因子受体EGFR的抑制剂包括吉非替尼、埃罗替尼和西妥昔单抗）、HER2的抑制剂例如，曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-艾美坦辛（曲妥珠单抗-DM1;T-DM1以及帕妥珠单抗）、抗-VEGF抗体和片段例如，贝伐单抗）、抑制CD20的抗体例如，利妥昔单抗、替伊莫单抗）、抗-VEGFR抗体例如，雷莫芦单抗（IMC-1121B、IMC-1C11和CDP791、抗-PDGFR抗体以及伊马替尼。小分子激酶抑制剂可能对特定酪氨酸激酶有特异或者是两种或更多种激酶的抑制剂。例如，化合物N-3,4_二氯-2-氟苯基）-7-{[3aR，6aS-2-甲基八氢环五[c]吡咯-5-基]甲基}氧基）-6-甲基氧基）喹唑啉-4-胺（也称为XL647、EXEL-7647和KD-019为几种受体酪氨酸激酶RTK，包括EGFR、EphB4、KDRVEGFR、Flt4VEGFR3和ErbB2的体外抑制剂，并且也是SRC激酶的抑制剂，所述SRC激酶参与导致肿瘤对某些TKI不响应的路径。在本发明的一个实施方案中，对有需要的受试者的治疗包括式I的rho-激酶抑制剂的施用和KD-019的施用。[0121]达沙替尼（BMS-354825;Bristol-MyersSquibb，NewYork为另一种口服可生物利用的、ATP-位点竞争性Src抑制剂。达沙替尼Dasatanib还革El向Bcr-AblFDA-批准用于患有慢性髓细胞性白血病CML或ph染色体阳性Ph+急性成淋巴细胞性白血病ALL以及：-1^、？06?1?、3-?134?1^2以及3?1。3代和8^4131的两种其他口服酪氨酸激酶抑制剂为博舒替尼（SKI-606和塞卡替尼AZD0530。[0122]虽然VEGFR2介导了血管生成中的大部分VEGF下游效果，但是施用第二血管生成抑制剂可以是有利的。本发明的抗-VEGFR-2抗体可以与中和参与肿瘤生长或血管生成的其他受体的抗体一起施用。[0123]VEGF-结合剂的非限制性实例包括VEGF抗体和VEGF捕获剂（S卩，VEGF受体的配体结合结构域。抗体包括VEGF结合抗体片段）的两个实例为贝伐单抗阿瓦斯丁），它是结合至VEGF-A的抗体，以及雷珠单抗雷珠单抗Lucentis，它是衍生自贝伐单抗的Fab。通常，VEGF捕获剂为包含一个或多个VEGF受体蛋白的VEGF结合结构域的蛋白质。VEGF-捕获剂包括但不限于可溶性VEGFR-1、可溶性神经毡蛋白INRPl、可溶性VEGFR-3它结合VEGF-C和VEGF-D以及阿柏西普Zaltrap;Eylea;VEGF捕获剂R1R2，由融合至人IgGl的恒定区（Fe的人血管内皮生长因子受体VEGFR1和VEGFR2的胞外结构域的区段组成。康柏西普ConberceptKH902为含有融合至人IgGl的Fc部分的VEGFR-IFlt-I的胞外结构域2和VEGFR-2KDR的胞外结构域3、4的融合蛋白。含有各种组合中的KDR和FLT-IIg-样结构域的几种VEGF捕获剂公开于美国专利8，216，575中。DARPin设计的锚蛋白重复蛋白的首字母缩写）为通常表现出高特异性和高亲和力靶蛋白结合的基因工程化的抗体模拟蛋白。DARPin®MP0ii2为血管内皮生长因子VEGF抑制剂并且已进入湿性黄斑变性和糖尿病黄斑水肿的治疗的临床试验中。[0124]根据本发明，可以靶向VEGF表达。例如，VEGF抑制剂PTC299通过选择性结合VEGF信使RNAmRNA的5,-和3,-非翻译区UTR来转录后靶向VEGF，从而防止VEGF的翻译。哌加他尼Macugen为针对VEGF-165的RNA适体。[0125]胎盘生长因子PlGF已参与病理性血管生成。PlGF在结构上与VEGF相关并且也是VEGFR-I的配体。因此，包含VEGFRl的胞外结构域（参见上文）的VEGF捕获剂适用于靶向P1GF。抗血管生成剂还包括结合至VEGFR-1Flt-l受体的那些。在某些实施方案中，结合至VEGFR-I的胞外结构域的抗原结合蛋白阻断由其配体VEGF和PlGF之一或二者进行的结合，和或中和VEGFR-I的VEGF-诱导的或PIGF-诱导的活化。[0126]MGF由形成同源二聚物PDGF-AA、BB、CC和DD以及异源二聚物TOGF-AB的四条多肽链组成。PDGF受体PDGFR-α和-β介导了PDGF功能。确切地说，PDGFRa结合至PDGF-AA、-BB、-AB和-CC，而TOGFRP与-BB和-DD相互作用。PDGF-结合剂的非限制性实例包括抗-PDGF抗体和PDGF捕获剂。靶向PDGF的药剂包括靶向PDGF-B的聚乙二醇化适体Fovista™E10030，Ophthotech和结合F1DGF-B的DNA寡核苷酸适体AX102Sennino等，2007，CancerRes·7515:7359-67。[0127]在本发明的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与有效量的PDGFRβ抗体一起施用给受试者[0128]靶向I3DGF受体的药剂包括抗-PDGFRα抗体雷莫芦单抗（IMC-3G3,人IgG1、PDGFRaIC5〇=0·9nM和PDGFRPIC5〇=I·8nM的选择性抑制剂克莱拉尼（crenolanibCP-868596以及PDGFRα和PDGFRβ以及其他酪氨酸激酶的抑制剂尼罗替尼Tasigna®。[0129]血管生成抑制剂包括阻断例如由VEGF、PDGF、VEGF或PDGF受体的配体或补体介导的信号转导的细胞内药剂。抑制血管生成抑制剂的细胞内药剂包括但不限于以下各项。舒尼替尼（Sutent;SUl1248为VEGFRl-VEGFR3、I3DGFRa和roGFRP、干细胞因子受体（cKIT、Flt-3以及集落刺激因子-1受体CSF-IR的泛特异性panspecific小分子抑制剂。阿西替尼AG013736;Inlyta为抑制VEGFR-1-VEGFR-3、PDGFR和cKIT的另一种小分子络氨酸激酶抑制剂。西地尼布（AZD2171为VEGFR-1-VEGFR-3、PDGFRβ和cKIT的抑制剂。索拉非尼Nexavar为若干种酪氨酸蛋白激酶，包括VEGFRJDGFR和Raf激酶的另一种小分子抑制剂。帕唑帕尼（Vorrient;GW786034抑制VEGFR-l、VEGFR-2和VEGFR-3、cKIT以及PDGFR0ForetinibGSK1363089;XL880抑制VEGFR2和MET，与卡博替尼（Cometriq;XL184—样。帕纳替尼（Iclusig;AP24534抑制VEGFR、PDGFR和c试剂盒。替聘扎尼（TivozanibAV-951在皮摩尔浓度下抑制VEGFR-I、VEGFR-2和VEGFR-3。CP-547632为VEGFR-2和碱性成纤维细胞生长因子FGF激酶的强效抑制剂。E-38106-7-1-氨基环丙基）甲氧基-6-甲氧基喹啉-4-基氧基）-N-甲基-1-萘甲酰胺）在纳摩尔范围内抑制VEGFR-I、VEGFR-2和VEGFR-3以及FGFR-I和-2激酶。布立尼布BMS-582664为也抑制FGF受体信号传导的VEGFR-2抑制剂。CT-322Adnectin为基于人纤连蛋白结构域的小蛋白质并且结合至VEGFR2并抑制它的活化。凡德他尼（Caprelas;Zactima;ZD6474为VEGFR2、EGFR和RET酪氨酸激酶的抑制剂。X-82Xcovery为通过生长因子受体VEGFR和PDGFR进行的信号传导的小分子吲哚酮抑制剂。[0130]在某些实施方案中，本发明的抗-VEGFR抗体与基质金属蛋白酶抑制剂共同施用。基质金属蛋白酶MMP诸如MMP-14、MMP-16和MMP-24裂解细胞外基质ECM和基底膜的组分，从而允许癌细胞穿透并渗入下层间质基质。另外，许多生长因子受体、细胞粘附分子、趋化因子、细胞因子、细胞凋亡配体以及血管生成因子为MMP的底物。因此，MMP活性可引起生长因子的活化、肿瘤细胞凋亡的抑制、由宿主免疫应答发展的趋化因子梯度的破坏或血管生成因子的释放。MMP可通过促进细胞增殖因子诸如结合至特异性结合蛋白的胰岛素样生长因子（IGFBP的释放来促成肿瘤生长Manes等，1997J.Biol.Chem.272:25706-25712。[0131]已发现胶原酶包括MMP-2在黑素瘤以及结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌中水平较高。通常，这些高水平与较高肿瘤级别和侵入力相关。MMP-2水平在患有转移性肺癌的患者的血清中显著提高，并且在具有高水平的患者中，对化学疗法的响应减弱。MMP-14裂解pr〇MMP-2以释放活性MMP-2,所述MMP-14在许多癌症中有所升高并且可以促成肿瘤生长、肿瘤栓塞和癌症的迀移、侵入和转移例如，CNS肿瘤例如，神经胶质瘤）、头颈癌、口腔癌、喉癌、软骨肉瘤、乳腺癌）和MMP-24也在许多癌症中有所升尚并且可以促成肿瘤生长和癌症例如，乳腺癌、喉癌、卵巢癌、睾丸癌、黑素瘤、脑肿瘤例如，星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤的侵入和转移。[0132]在某些实施方案中，本发明的抗-VEGFR抗体与MMP-14拮抗剂共同施用，所述MMP-14拮抗剂包括但不限于美国专利7，745，587和8，106，168中公开的抗-MMP-14抗体。在一个实施方案中，抗体为人单克隆抗体DX-2400DyaxCorp。与此抗体的共同施用适用于治疗人恶性肿瘤，包括但不限于子宫颈肿瘤、胃肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、头颈部肿瘤、恶性脑肿瘤以及黑素瘤。[0133]在另一个实施方案中，本发明的VEGFR2抗体可以与一种或多种适合的佐剂例如像细胞因子例如IL-10和IL-13或其他免疫刺激物组合施用。然而，应当了解，仅抗-KDR抗体的施用是足以以治疗有效的方式预防、抑制或减少肿瘤的进展。[0134]抗炎剂和免疫抑制剂包括类固醇药物，诸如糖皮质激素例如，地塞米松）、FK506他克莫司）、环孢素、芬戈莫德fingolimod、干扰素诸如IFNβ或IFNy、肿瘤坏死因子-αTNF-α结合蛋白（诸如英夫利昔单抗（Remicade、依那西普（Enbrel或阿达木单抗Humira以及霉酚酸。[0135]某些实施方案包括施用本发明的抗体和如下第二种药剂:多西他赛用于实体瘤，包括乳腺癌和泌尿道癌和肾癌）、紫杉醇（实体瘤、胃腺癌）、FOLFRIS卩，伊立替康irinotican、甲酰四氢叶酸、5-氟尿啼啶）（用于结肠直肠癌）、卡培他滨乳腺癌）、F0LF0X即，奥沙利铂、亚叶酸、5-氟尿嘧啶）（胃癌、食管癌、胃食管癌）、艾日布林eribulin乳腺癌）、F0LFIRI即，伊立替康、左亚叶酸盐、5-氟尿嘧啶）（结肠直肠肿瘤）、卡铂NSCLC、米托蒽醌和泼尼松前列腺癌）、〇FF亚叶酸奥沙利铂、5-氟尿嘧啶）（结肠直肠癌）、伊立替康和西妥昔单抗结肠直肠癌）以及达卡巴嗪恶性黑素瘤）。[0136]本发明的抗体和抗原结合片段可以缀合至药剂，例如细胞毒性药物、细胞毒素酶或放射性同位素。这种方法包括向需要此治疗的受试者施用单独的结合蛋白或附接至药剂例如，细胞毒性药物）的结合蛋白。例如，VEGFR2抗体或其片段可用于向VEGFR2相关细胞或组织例如，肿瘤递送含有药剂诸如毒素的纳米颗粒。[0137]VEGFR2结合蛋白可以在体内直接用于通过天然补体依赖性细胞毒性CDC或抗体依赖性细胞毒性ADCC来消除表达抗原的细胞。本文所述的结合蛋白可以包括补体结合效应子结构域，诸如来自IgGl、_2或-3的Fc部分或结合补体的IgM的相应部分。[0138]当本发明的VEGFR-2抗体与第二药剂一起施用时，第一药剂和第二药剂依次或同时施用。每种药剂可以单个或多个剂量施用，并且所述剂量可以按任何方案施用，所述方案包括但不限于每日两次、每日一次、每周一次、每两周一次以及每月一次。[0139]本发明还包括辅助施用。辅助施用意味着除了已经施用来治疗疾病或疾病症状的第一药剂之外还向患者施用第二药剂。在一些实施方案中，辅助施用包括向患者施用第二药剂，在所述患者中第一药剂的施用并未治疗或并未足以治疗疾病或疾病症状。在其他实施方案中，辅助施用包括向已通过施用第一药剂来有效治疗疾病的患者施用第二药剂。[0140]在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过注射施用，小分子通过口服施用。在一个此类实施方案中，抗体每周施用一次或每月施用一次或两次并且小分子通过口服施用。[0141]在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过注射施用，并且R0CK2抑制剂通过口服施用。在优选的实施方案中，所述药剂每日施用一次。根据本发明，当向受试者施用ROCK抑制剂或VEGFR2抗体以治疗眼部疾病时，可以向受试者施用TGF-β拮抗剂，以减少或预防瘢痕。例如，在本发明的一个实施方案中，当施用ROCK抑制剂以治疗眼部病症时，也施用TGF-β拮抗剂。在另一个实施方案中，当向受试者施用VEGF拮抗剂以治疗眼部病症时，还施用TGF-β拮抗剂。在本发明的另一个实施方案中，当向受试者施用ROCK抑制剂和VEGF拮抗剂以治疗眼部病症时，也施用TGF-β拮抗剂。在涉及新生血管形成的眼部病症中，发生新血管渗漏，随后发生瘢痕形成例如，盘状瘢痕discaformscar。本发明包括向受试者施用TGF-β拮抗剂以及VEGF拮抗剂和R0CK2抑制剂，以治疗眼部疾病中的新生血管形成。[0142]有用的TGF-β拮抗剂包括但不限于以下各项：⑴抗-TGFP抗体及其抗原结合片段，诸如pan-TGF-β抗体GC-1008Genzyme、抗-TGF-βΙ抗体美替木单抗（CAT-192CambridgeAntibodyTechnology和那些抗体的抗原结合片段，（ii可溶性TGF-β受体或其配体结合片段，诸如包含来自TGF-WII型受体的近膜配体结合结构域的氨基酸730-743的合成肽P144伍8口^-[0口62等，2001，了.8101.：116111.27618:14588-96，以及11型丁6卩-0受体-卩。IgGi融合蛋白（Smith，J.等，1999，CiFculationRes.84:1212-22，（iii结合至TGF-β受体的肽，所述肽阻断结合至TGF-β受体的一种或多种TGF-β同种型，诸如来自由Huang等，1997，J.Biol.Chem.272:27155-59公开的TGF-0i、TGF-fe和TGF-^3的25个氨基酸肽，以及iv抑制TGF-β合成的反义齐I」，诸如抑制TGF-02合成的寡核苷酸曲贝德生（trabedersenAntisensePharmaGmbH。另外拮抗剂公开于WO2006052568、W002094833、W004048382、W004048381、W004050659、W004021989、W004026871以及WO04026307。[0143]在本发明的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段连同有效量的PD-Ll抗体一起施用给受试者参见US61927,907和PCTUS1511657,所述专利以引用的方式整体并入本文）。[0M4]在某些实施方案中，向受试者施用一个剂量的化合物或组合物，每天一次、每隔一天一次、每几天一次、每三天一次、每周一次、每周两次、每周三次或每两周一次。在其他实施方案中，向受试者施用两个、三个或四个剂量的化合物或组合物，每天一次、每几天一次、每三天一次、每周一次或每周两次。在一些实施方案中，施用一个剂量的化合物或组合物，持续2天、3天、5天、7天、14天或21天。在一些实施方案中，施用一个剂量的化合物或组合物，持续1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。[0145]施用方法包括但不限于胃肠外、皮内、玻璃体内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经粘膜、直肠、通过吸入、或局部，特别是施用到耳、鼻、眼或皮肤。施用模式由执业医师判断。在大多数情况下，施用将导致化合物释放到血液中。对于眼部疾病的治疗，优选生物药剂的玻璃体内施用。[0146]在特定实施方案中，可能希望局部施用化合物。这可通过以下实现，例如但不限于通过局部输注、局部涂敷、通过注射、借助于导管、借助于植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜诸如硅橡胶膜或纤维。在此类情况下，施用可选择性靶向局部组织而不会将化合物大量释放到血流中。[0147]还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有雾化剂的制剂，或者经由以碳氟化合物或合成的肺表面活性物质输注。在某些实施方案中，化合物还可用传统粘合剂和媒介物如甘油三酯配制成栓剂。[0148]在另一个实施方案中，化合物以囊泡递送，具体地说为脂质体（参见，Langer，1990，Science249:1527-1533;Treat等，在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandBacterialinfection，Lopez-Berestein和Fidler编著），Liss，NewYork，第353-365页（1989中；LopezBerestein，出处同上，第317-327页；大体上参见以上）。[0149]在另一个实施方案中，化合物以控制释放系统递送（参见，例如，Goodson，inMedicalApplicatiohsofControlledRelease，同上，第2卷，第115-138页（1984。可使用在Langer，1990，Science249:1527-1533的综述中讨论的控制释放系统的实例。在一个实施方案中，可使用栗（参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald等，1980，Surgery88:507;Saudek等，1989，N·Engl·J·Med·321:574。在另一个实施方案中，可使用聚合材料参见，MedicalApplicatiohSofControlledRelease，Langer和Wise编辑），CRCPres.，BocaRaton，Florida1974!ControlledDrugBioavailabiIity,DrugProductDesignandPerformance，Smolen和Ball编辑），Wiley，NewYork1984;Ranger和Peppas，1983，J.Macromol·Sci·Rev.Macromol·Chem.23:61;还参见Levy等，1985,Science228:190;During等，1989，Ann·Neurol·25:351;Howard等，1989，J.Neurosurg.71:105〇[0150]仅出于说明目的提供上述施用方案并且所述方案不应视为限制性的。本领域普通技术人员将容易理解的是，所有剂量均处于本发明的范围内。[0151]应当理解和预期的是，本文所公开的本发明的理论的变化可以由本领域技术人员所做出并且预期此类修改被包括在本发明的范围内。[0152]贯穿本申请，引用了各种公布。这些出版物均以引用的方式整体并入本申请，以便更全面地描述本发明所涉及的技术现状。以下实施例进一步说明了本发明，但是不应理解为以任何方式限制本发明的范围。实施例[0153]实施例1[0154]结合至VEGFR结构域2和3并阻断配体结合的抗体的鉴定。[0155]将结合至人VEGFR2并中和所述人VEGFR2的在表1中鉴别的两种抗体从人Fab噬菌体展示文库中分离。所述抗体阻断配体VEGFA与hVEGFR2的结合（图2。所述抗体还结合至表达KDR的猪主动脉血管内皮PAE细胞，并且抑制VEGFR2、AKT和MAPK的VEGFA刺激的磷酸化。图3。表1指示抗体的⑶R和可变结构域的氨基酸序列。Mab101和Mab102的Kd分别为约6.6mM和1.7nM。[0156]Mab101的重链使用κ轻链基因（K-文库）和λ轻链基因（λ-文库）改组。通过淘选针对人VEGFR2和小鼠VEGFR2的λ-文库发现20种独特的λ轻链变体。通过淘选针对人VEGFR2和小鼠VEGFR2的κ-文库发现22种独特的κ轻链变体。表2指示轻链的CDR和可变结构域的氨基酸序列。Mab105、Mab106和Mab107的Kd增加约10倍（分别为0.24ηΜ、0.22ηΜ和0.12ηΜ表3。这些抗体和它们所来源的抗体MablOl结合至VEGFR的结构域2和3并且结合至含有那些结构域的构建体。[0157][0158]与亲本抗体一样，这些抗体结合至VEGFR2并且阻断VEGFA与VEGFR2的结合（图4，并且抑制VEGFR2、AKT和MAPK的VEGFA刺激的磷酸化图5。[0159]几种抗体，包括Mab138、Mab139、Mab140和Mab146,也与小鼠VEGFR2交叉反应。[0160][0161]Mab138、Mab139和Mab140抑制VEFGR2的VEGFA-刺激的磷酸化和下游信号转导分子包括MAPK〇[0162]实施例2[0163]肿瘤生长的体内抑制[0164]将6至8周大的性别匹配的（雌性NOD-SCID小鼠用来自mCsγ射线来源的3.5Gy以约0.9Gymin的剂量率辐射处理并且用2xl07个HL60细胞静脉内接种。在肿瘤接种后三天，将小鼠组用各种剂量的Mab106每周处理两次，并且记录存活时间。[0165]所有未处理小鼠均在约两周内死亡。甚至在高肿瘤负荷的情况下，使用10mgkgMab106进行处理的小鼠的存活时间延长多至28天。[0166]实施例3[0167]人患者中的结肠癌的治疗[0168]将诊断患有结肠癌的人受试者分成治疗组和给予标准化学治疗方案。将两个患者组用5mgkg周或15mgkg周每周处理一次，持续4个月。对照组仅给予标准化学治疗方案。通过磁共振成像MRI周期性地评估肿瘤负荷。与对照组相比，预期已每周接受抗体治疗的患者显示肿瘤生长或肿瘤尺寸的显著减小，与并未接受抗体治疗的患者相比进展的延迟增加或存活延长。[0169]选择含有MablOl的重链SEQIDNO.4;参见图6A的Mab138表2用于亲和力成熟。将突变引入到轻链的CDR3和重链的CDRl、CDR2和CDR3中。在人和鼠VEGFR2上淘选所得文库。表5指示所得抗体的五个中的重链和轻链CDR和可变结构域的氨基酸序列。图6示出所述序列与Mab138重链SEQIDNO.4和κ轻链（g卩SEQIDNO:160的比较。[0170][0171]通过Biacore分析测定Mab147和Mab149的结合常数以及人、鼠和大鼠VEGFI^9亲本Mab138表6。[0174]通过ELISA评价Mab147的受体结合和配体阻断特性。Mab147以类似亲和力结合至可溶性hVEGFR2和可溶性mVEGFR2图7A〇Mabl47阻断配体与类似于hVEGFR特异性对照抗体的hVEGFR2的结合并且还阻断配体与类似于mVEGFR2特异性对照抗体的mVEGFR2的结合图7B。[0175]还确认Mab147与细胞膜上表达的hVEGFR2和mVEGFR2的结合。图8A示出与由人脐静脉内皮细胞HUVEC以及过表达KDRS卩，人VEGFR2的猪主动脉血管内皮PAE细胞表达的hVEGR2的结合。Mabl47还结合至由MSl鼠内皮细胞表达的mVEGFR图8B。[0176]Mab147抑制VEGFR-2介导的信号转导，如通过KDR-PAE细胞（图9A和HUVEC细胞图9B中KDR和p4244的减少的磷酸化所指示的。Mab106和Mab147抑制KDR-PAE细胞的增殖（图10A，并且抑制KDR-PAE细胞的VEGF诱导的迀移（图10B。图11也示出了Mab147对由KDR-PAE细胞进行的VEGF-诱导的迀移的抑制的作用。[0177]Mab147也抑制鼠EOMA细胞中的VEGFR-2介导的信号转导，如通过mVEGFR2减小的磷酸化所指示的（图12AAACS研究表明Mab147与对照抗体相比具有增加的与EOM细胞的结合（图12B。

权利要求：1.一种结合至人VEGFR2的分离抗体或其片段，其包含含有⑶RlXDR2和⑶R3序列的重链可变结构域，其中：⑴所述CDRl序列为GFTFSWYVMGSEQIDN0:237，ii所述⑶R2序列选自由以下组成的组SIYPQGGATSYADSVKGSEQIDNO：238,SIYPQGGATNYADSVKGSEQIDN0:239以及SIYPSGGATNYADSVKGSEQIDN0:240;并且ii所述⑶R3序列选自由以下组成的组GNYFDYSEQIDNO:241，GNYLDYSEQIDNO:242，GPYLDYSEQIDN0:243以及GSYLDYSEQIDNO:244，条件是所述重链可变结构域不包含SEQIDNO:240的所述⑶R2序列和SEQIDNO:241的所述⑶R3序列。2.如权利要求1所述的抗体或片段，其包含含有CDRl、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域，其中⑴所述CDRl序列为RASQSVSSNYFGSEQIDN0:245，ii所述CDR2序列为GASSRATSEQIDN0:246，并且iii所述⑶R3序列选自由以下组成的组QQFDSLPLTSEQIDNO：247,QQHDSSPLSSEQIDNO：248,QQFDSSPLSSEQIDN0:249以及QQFDSSPLTSEQIDN0：250〇3.如权利要求I所述的抗体或片段，其中所述重链可变结构域的所述CDR2具有序列SIYPQGGATSYADSVKGSEQIDN0:238，并且所述重链可变结构域的所述CDR3具有序列GNYFDYSEQIDNO:241。4.如权利要求2所述的抗体或片段，其中所述轻链可变结构域的所述CDR3具有序列QQFDSLPLTSEQIDNO:247。5.如权利要求1所述的抗体或片段，其中所述重链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列：SEQIDN0:200、SEQIDN0:208、SEQIDN0:216、SEQIDN0:224以及SEQIDNO:232〇6.如权利要求2所述的抗体或片段，其中所述轻链可变结构域具有选自由以下组成的组的序列：SEQIDN0:204、SEQIDN0:212、SEQIDN0:220、SEQIDΝ0:228以及SEQIDNO:236。7.如权利要求2所述的抗体或片段，其中所述重链可变结构域具有序列SEQIDNO:200,并且其中所述轻链可变结构域具有序列SEQIDNO:204。8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或片段，其为同种型IgG。9.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或片段，其为scFv、Fv、Fab’、Fab、Fab’）2Sl抗体。10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段结合至人VEGFR2和鼠hVEGFR2。11.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段。12.—种核酸载体，其包含根据权利要求11所述的分离的核酸。13.—种原核或真核宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的分离的核酸。14.一种组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段和药学上可接受的载体。15.—种中和人VEGFR2或鼠VEGFR2的活化的方法，其包括将细胞与有效量的如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段接触。16.—种抑制血管生成的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段。17.—种减少肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段。18.—种治疗受试者的肿瘤性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求1-10中任一项所述的抗体或片段，其中所述肿瘤性疾病选自由以下组成的组:肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌以及胰腺癌。19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的表皮生长因子受体EGFI?拮抗剂。20.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的fms-样酪氨酸激酶受体tflt-1拮抗剂。21.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的rho相关激酶2R0CK2拮抗剂。22.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的基质金属蛋白酶拮抗剂。23.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的PDGFRf^t体。24.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括向受试者施用有效量的PD-L1抗体。25.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述患者是人。

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