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申请/专利权人：重庆三峡学院

摘要：本发明提供一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ‑葡萄糖苷酶抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列为色氨酸‑丝氨酸，结构式为：本发明要解决的技术问题是提供一种天然的辅助降血糖效果好的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ‑葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。

主权项：1.经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，一、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；二、利用蛋白酶M酶解山杏仁蛋白制备山杏仁蛋白酶解物多肽；三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，所述山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的序列为色氨酸-丝氨酸；所述步骤二中，利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽的方法为：蛋白酶M对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解后灭酶10min，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽；蛋白酶M的酶解条件为pH为7.0，温度50℃，底物浓度为50mgmL，酶添加量与底物的质量比为0.02mgmg，酶解时间6h；山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸，结构式为：

全文数据：经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。背景技术[0002]糖尿病已经成为与心脑血管疾病、癌症、慢性呼吸系统疾病并称的四大威胁人类健康的慢性病之一。通常糖尿病患者通过摄入胰岛素的方法来降低胰岛素抵抗的影响。但是患者长期服用胰岛素会导致胰岛素分泌受损和细胞的损失Clark，1998。糖尿病作为一种慢性疾病对患者的正常生活造成极大的不便，患者会产生疲劳感并且嗜睡，患病严重的成年人甚至会丧失劳动能力。糖尿病人治疗的唯一方法是服用降糖类药物，但是目前开发的降糖药物主要是以化学合成或生化试剂为主，并且这些药物并不能完全治愈糖尿病。因此对副作用小的天然的降糖药物的研究迫在眉睫。降糖药物主要分为胰岛素及其类似药物、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、蛋白质糖基化抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素样生长因子和醛糖还原酶抑制剂。[0003]α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类有效的糖尿病治疗药物，可竞争性抑制小肠内各种α-葡萄糖苷酶活性，减缓α-葡萄糖苷酶对碳水化合的消化作用，减慢淀粉分解成葡萄糖的速度及肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。目前市售的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物主要有阿卡波糖acrbose、伏格列波糖voglibose和米格列醇midlitol，但是这类药物作为处方药长期服用通常会产生一些副作用，如胃胀气、肠绞痛、腹胀或腹泻等。这些药物都是非水解糖类的类似物，对胰腺中的α-淀粉酶抑制能力较强而对小肠上皮的α-葡萄糖苷酶抑制能力较弱，从而使糖类物质在小肠内吸收障碍而停留在小肠，导致被肠道细菌酵解产生较多的气体，造成人体胃肠道不适。[0004]因此，研发对小肠上皮的α-葡萄糖苷酶抑制能力较强而对胰腺分泌的α-淀粉酶抑制能力较弱的药物，一方面减少α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的副作用，另一方面又控制了餐后血糖水平，是一种理想降糖类药物的研发方向。[0005]山杏是传统的药用植物，山杏仁是优质的植物蛋白源，它的氨基酸组成接近世界粮农组织FAO的标准，主要由易消化的代谢蛋白组成，具有典型的植物蛋白的物化特性。脱苦处理之后的山杏仁蛋白安全无毒，可以开发多种有益生理健康的生物活性和医用价值。山杏仁蛋白源生物活性肽的研究有着广阔的前景，近年来，国内外学者对其进行了深入的研究。山杏仁蛋白作为优质的易消化的植物蛋白，也是生物活性肽的良好来源。它具有降血糖、降血脂、降血压、提高免疫力、抗癌以及抑菌等生物活性，但是山杏仁蛋白源的α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离纯化和活性研究在国内外尚属于空白领域。本发明是在发明人在通过系统地分析山杏仁蛋白及其肽的抗氧化能力，筛选出高纯度高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽，并研究山杏仁多肽的体内降血糖能力中得到的一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽。发明人在研究的过程中，经过先对山杏仁蛋白的提取及其提取工艺，对山杏仁蛋白氨基酸组成分析研究后，再利用蛋白酶酶解山杏仁蛋白得到活性肽，研究得到经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽。发明内容[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种α-葡萄糖苷酶抑制活性效果好的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：[0008]经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽，其氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸，结构式为：[0009]采用本发明的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽，其实际分子量为291.31gmol。通过测定的E的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC5q值为0.013±0.06mgmL;以分子量为依据，以ymolL为单位，计算得到肽E的IC5q值为44.63±0.03ymolL。[0010]本发明还提供另外一种技术方案:经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤，[0011]—、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；[0012]二、利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽；[0013]三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽。[00Μ]进一步，所述步骤二中，利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽的方法为：蛋白酶M对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解后灭酶IOmin，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽。[0015]进一步，所述步骤二中，蛋白酶M的酶解条件为pH为7.0，温度50°C，底物浓度为50mgmL，酶添加量与底物的质量比为0.02mgmg，酶解时间6h。[0016]进一步，所述的步骤三中，对经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化的方法为：[0017]a、超滤酶解液后，真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉；[0018]b、凝胶层析分离；[0019]c、反相高效液相色谱分离；[0020]d、分子筛分呙；[0021]e、反相高效液相色谱纯化，得到α-葡萄糖苷酶抑制肽。[0022]进一步，所述步骤a中，超滤酶解液后，收集分子量重庆三峡学院[0095]〈120经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法[0096]1[0097]1[0098]2[0099]PRT[0100]Artificial[0101]〈220[0102]α-葡萄糖苷酶抑制肽[0103]1[0104]Trp-Ser0[0105]对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

权利要求：1.经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽，其特征在于:其氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸，结构式为：2.根据权利要求1所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:包括以下步骤，一、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；二、利用蛋白酶M酶解山杏仁蛋白制备山杏仁蛋白酶解物多肽；三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽。3.根据权利要求2所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述步骤二中，利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽的方法为：蛋白酶M对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解后灭酶IOmin，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽。4.根据权利要求3所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述步骤二中，蛋白酶M的酶解条件为pH为7.0，温度50°C，底物浓度为50mgmL，酶添加量与底物的质量比为0.02mgmg，酶解时间6h。5.根据权利要求4所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述的步骤三中，对经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化的方法为：a、超滤酶解液后，真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉；b、凝胶层析分离；c、反相高效液相色谱分离；d、分子筛分离；e、反相高效液相色谱纯化，得到α-葡萄糖苷酶抑制肽。6.根据权利要求5所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述步骤a中，超滤酶解液后，收集分子量5kDa的酶解液，真空冷冻干燥。7.根据权利要求6所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述步骤一中，等电点沉淀法中，1取脱脂山杏仁柏粉，按照液料比加入去离子水，配制成山杏仁蛋白溶液；2超声使样品蛋白溶出，调节反应溶液的pH、温度，搅拌提取；3提取后，取浸提液离心，收集上清液；4用lmolLHCl调节上清液pH至山杏仁蛋白的等电点，离心，弃去上清液，收集沉淀；5用去离子水使沉淀复溶，调节溶液pH值，冷冻干燥，得山杏仁蛋白。8.根据权利要求7所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述步骤一的2中，提取温度为37°C，提取时间为60min，pH为9.0，所述的步骤一的1中，液料比为14mLg。9.根据权利要求8所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于:所述的步骤一的4中，山杏仁蛋白的等电点为pi4.1。

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