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申请/专利权人：山西省农业科学院作物科学研究所

摘要：本发明具体是一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，解决了现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题。a、选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种；b、将粗山羊草的花粉授至硬粒小麦；c、进行培养灭菌；d、将灭菌后籽粒的幼胚接种于培养基II上培养；e、待幼苗时进行春化培养；f、将幼苗移栽于大田；g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1％的秋水仙素溶液浸泡处理，随后继续进行田间培养管理直至收获。本发明适用于北方冬麦区的小麦新材料的合成及育种。

主权项：1.一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于：采用如下步骤：a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔3-5天，粗山羊草第一期播种；b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后48-72小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；c、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下30-40cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为21℃-25℃，培养湿度为80％，光照为1500lux-2500lux，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgNO310mgL，H2SO38mgL，KH2PO43gL，2,4-D100mgL；d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为21℃-25℃，光照为1500lux-2500lux，每天光照12小时；发育良好的幼胚接种于培养基II中培养；发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2mgL的2,4-D；如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入培养基IV中，在培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3mgL的6-BA和质量体积浓度为0.1mgL的NAA；e、待幼胚长至高度为10-15cm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养30-35天，培养温度为日间10℃-15℃、夜间0℃-4℃，日间光照12小时，光照强度为1000lux-2000lux；f、当日平均气温低于10℃时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚；当日平均气温超过10℃时，揭去塑膜；g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1％的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。

全文数据：一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法技术领域[0001]本发明涉及农业种植技术领域，尤其涉及小麦的合成方法，具体为一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法。背景技术[0002]普通小麦（TriticumaestivumL,AABBDD，2n=6x=42是世界上主要的粮食作物之一，播种面积和产量均居世界第一，它是占世界人口35%的主要粮食作物。在普通小麦进化过程中，只有极少数栽培二粒小麦与粗山羊草通过天然杂交形成了六倍体小麦，造成了六倍体小麦的遗传多样性与其亲本相比大为下降，产生了“进化瓶颈”。[0003]70年代以来，由于半矮杆高产小麦品种的育成和大面积推广，替代了变异类型丰富的、适应性好的小麦地方品种。这种长期人为的定向选择育种，加速了小麦群体遗传多样性的散失和各种病害的加重，而长期的小麦品种间的杂交育种，使其遗传基础愈来愈窄，遗传变异愈来愈小。[0004]根据物种遗传关系的远近可将小麦基因源分为三级。一级基因源为:含有A、B、D三个基因组的品种、品系及原始种；二级基因源为:含有A、B、D三个基因组中的一个或两个基因组的物种;三级基因源为:不含A、B、D三个基因组中任何一个基因组的物种。一级基因源中的基因通过直接杂交、同源染色体交换、回交和选择很容易进行转移，二级基因源中与小麦同源染色体上的基因也可通过直接杂交、同源染色体交换、回交和选择进行转移，但难度略大。[0005]山羊草属Aegilops是与小麦属Triticum亲缘关系最近的一个属，而粗山羊草AegilopstauschiiCoss.Schmal，DD，2n=14是和小麦最近的种之一，粗山羊草与普通小麦的D染色体组完全同源，可发生遗传物质的自由重组和交换，二者杂交无负遗传效应，并且粗山羊草含有丰富的抗病、抗虫、优质亚基、耐旱、耐寒及耐盐等优异基因，其遗传多样性远比小麦的D染色体组丰富。[0006]硬粒小麦T.durum又称通心粉小麦，染色体组型为AABB。存在着锈病、黄矮病、纹枯病、白粉病、黑穗病、麦蝇等多种病虫害的抗源。因此，硬粒小麦和粗山羊草都是用来改良普通小麦是非常好的选择。[0007]目前，由粗山羊草和硬粒小麦合成的小麦存在以下问题:其一，不适宜我国冬麦区育种使用，目前我国使用的大都来自CMMYT国际玉米小麦改良中心），而这些合成麦大都是春性的，不适合我国北方冬麦和黄淮海冬麦区使用；其二，母本的选择受局限，进而存在遗传信息的局限性，目前在我国还有一部分合成麦来自带自然加倍基因的硬粒小麦Langdon和粗山羊草合成，母本只能选择Langdon，遗传信息非常狭窄；其三，成胚率极低，在10%左右，成苗率在4%左右。发明内容[0008]本发明为了解决现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题，提供了一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法。[0009]本发明是采用如下技术方案实现的：[0010]一种高遗传多样性且高成胚成苗率冬麦区小麦的合成方法，采用如下步骤：[0011]a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔3-5天，粗山羊草第一期播种；[0012]b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后48-72小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；[0013]C、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下30-40cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为21°C_25°C，培养湿度为80%，光照为15001ux-25001UX，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；[0014]d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为21°C_25°C，光照为15001ux-25001ux，每天光照12小时；[0015]e、待幼胚长至高度为10-15cm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养30-35天，培养温度为日间I〇°C-15°C、夜间0°C-4°C，日间光照12小时，光照强度为1000lux-2000Iux;[0016]f、当日平均气温低于HTC时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚;当日平均气温超过10°C时，揭去塑膜；[0017]g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0018]硬粒小麦为四倍体，染色体组型为AABB，选择硬粒小麦作为母本，母本产生配子的染色体组型为AB;粗山羊草为二倍体，染色体组型为DD，选择粗山羊草作为父本，父本产生配子的染色体组型为D;经过授粉后形成染色体组型为ABD的单倍体小麦，将该小麦籽粒的幼胚剥离，培养至幼苗，通过在合适培养基内生长提高种子的成胚率和成苗率，并经过春化使之能够正常抽穗。使用浓度为1%的秋水仙素溶液处理根系，使得细胞内染色体数量加倍，其染色体组型为AABBDD，继续进行大田培养;而且母本硬粒小麦的选择范围较宽，大幅提升了遗传的多样性，克服了现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题。[0019]液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgNO31OmgL，H2S038mgL，KH2P〇43gL，2，4-D100mgL。[0020]步骤d中发育良好的幼胚接种于培养基II中培养;发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2molL的2，4-D;如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入液体培养基IV中，在液体培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3molL的6-BA和质量体积浓度为0.lmolL的NAA。[0021]培养基II、III、IV的配合使用保障幼胚正常发育，进一步提高种子的成胚率、成苗率，其中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸。[0022]步骤g中当幼苗长出2-3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为10-15cm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0023]本发明选用的硬粒小麦和粗山羊草是普通小麦的二级基因源，由于母本不受限的特点，扩大了母本遗传信息选择的范围，通过远缘杂交、幼胚培养和染色体加倍人工合成六倍体或双二倍体小麦，将硬粒小麦与粗山羊草中蕴藏的大量有用和被长期定向选择丢失的基因有效的导入普通小麦，拓宽小麦的遗传基础。[0024]本发明操作过程简单，方便可行，生产成本低，通过本发明提供的方法，种子的成胚率、成苗率明显提高，与此同时，通过增加春化的过程，使种子能顺利进入幼苗期进而适应北方冬麦区的温度环境，克服了温度对其生长的不利影响，有效解决了现有合成小麦存在冬麦区不适用、遗传信息受局限且成胚成苗率低的问题。本发明适用于北方冬麦区的小麦新材料合成及育种。[0025]经上述方法所得种子，经试验检测，其成胚率达到80%以上，成苗率达到90%以上。试验数据见表1、表2;[0026]表1[0029][0030]表2[0031]具体实施方式[0032]实施例1[0033]一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，采用如下步骤：[0034]a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔3天，粗山羊草第一期播种；[0035]b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后48小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；[0036]c、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下30cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为21°C，培养湿度为80%，光照为15001ux，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；[0037]d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为21°C，光照为15001UX，每天光照12小时；[0038]e、待幼胚长至高度为IOcm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养30天，培养温度为日间10°C、夜间TC，日间光照12小时，光照强度为lOOOlux;[0039]f、当日平均气温低于10°C时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚;当日平均气温超过10°c时，揭去塑膜；[0040]g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0041]液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgNO31OmgL，H2S038mgL，KH2P〇43gL，2，4-D100mgL。[0042]步骤d中发育良好的幼胚接种于培养基II中培养;发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2molL的2，4-D;如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入培养基IV中，在培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3molL的6-BA和质量体积浓度为0.lmolL的NAA。[0043]步骤g中当幼苗长出2个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为IOcm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0044]实施例2[0045]一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，采用如下步骤：[0046]a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔5天，粗山羊草第一期播种；[0047]b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后72小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；[0048]c、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下40cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为25°C，培养湿度为80%，光照为25001UX，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；[0049]d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为25°C，光照为25001UX，每天光照12小时；[0050]e、待幼胚长至高度为15cm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养35天，培养温度为日间15°C、夜间4°C，日间光照12小时，光照强度为20001ux;[0051]f、当日平均气温低于HTC时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚;当日平均气温超过10°C时，揭去塑膜；[0052]g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0053]液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgNO310mgL，H2S038mgL，KH2P〇43gL，2，4-D100mgL。[0054]步骤d中发育良好的幼胚接种于培养基II中培养;发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2molL的2，4-D;如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入培养基IV中，在培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3molL的6-BA和质量体积浓度为O.lmolL的NAA。[0055]步骤g中当幼苗长出3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为15cm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0056]实施例3[0057]一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，采用如下步骤：[0058]a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔4天，粗山羊草第一期播种；[0059]b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后51小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；[0060]C、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下37cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为22°C，培养湿度为80%，光照为19001UX，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；[0061]d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为23°C，光照为22001UX，每天光照12小时；[0062]e、待幼胚长至高度为12cm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养32天，培养温度为日间14°C、夜间TC，日间光照12小时，光照强度为12001ux;[0063]f、当日平均气温低于10°C时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚;当日平均气温超过10°c时，揭去塑膜；[0064]g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0065]液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgNO31OmgL，H2S038mgL，KH2P〇43gL，2，4-D100mgL。[0066]步骤d中发育良好的幼胚接种于培养基II中培养;发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2molL的2，4-D;如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入培养基IV中，在培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3molL的6-BA和质量体积浓度为0.lmolL的NAA。[0067]步骤g中当幼苗长出3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为Ilcm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。[0068]具体实施过程中，如剪下的植株不能及时插入液体培养基I，需要先将剪断处用湿毛巾包好;在液体培养基中I培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来后，通过在浓度为75%的酒精浸泡5分钟，浓度为0.5%。的升汞浸泡10分钟并用无菌水冲洗3-4次完成消毒过程。

权利要求：1.一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于:采用如下步骤：a、按质量份数比2:1选取硬粒小麦和粗山羊草进行播种，硬粒小麦分三期播种，每期间隔3-5天，粗山羊草第一期播种；b、选取硬粒小麦作为母本，选取粗山羊草作为父本，对母体硬粒小麦进行去雄、套袋，去雄后48-72小时，用新采集的粗山羊草花粉授粉并套袋；c、授粉24小时后，将硬粒小麦植株穗下30-40cm剪下，并用自来水冲洗剪断处30s后，插入液体培养基I中培养，培养温度为21°C_25°C，培养湿度为80%，光照为15001ux-25001ux，每天光照8小时，培养14天后，将小麦籽粒从麦穗中剥离出来进行灭菌；d、在超净台上剥离灭菌后小麦籽粒的幼胚并接种于培养基II上培养，培养基II为12MS培养基，培养温度为21°C-25°C，光照为1500lux-2500Iux，每天光照12小时；e、待幼胚长至高度为10-15cm的幼苗时置于人工培养箱进行春化培养30-35天，培养温度为日间I〇°C-15°C、夜间0°C-4°C，日间光照12小时，光照强度为1000lux-2000Iux;f、当日平均气温低于l〇°C时，将经过春化的幼苗移栽于大田，选取靠墙的阳畦搭建塑膜拱棚;当日平均气温超过10°C时，揭去塑膜；g、待幼苗长出分蘖时，用浓度为1%的秋水仙素溶液浸泡处理幼苗的12根系8小时，二周后接着处理幼苗的另外12根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。2.根据权利要求1所述的一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于:液体培养基I的PH值为5.8-6.4，且液体培养基I是由如下质量体积浓度的原料组成的：蔗糖40gL，AgN0310mgL，H2S038mgL，KH2P〇43gL，2,4-D100mgL。3.根据权利要求I或2所述的一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于：步骤d中发育良好的幼胚接种于培养基II中培养;发育不良的幼胚接种于培养基III中，待幼胚发育正常后转入培养基II中，培养基III是在培养基II中加入质量体积浓度为2molL的2，4-D;如在培养基III内继续不良发育的幼胚转入培养基IV中，在培养基IV中的幼胚发育正常后转入培养基II，培养基IV是在培养基II中加入质量体积浓度为3molL的6-BA和质量体积浓度为0.lmolL的NAA。4.根据权利要求1或2所述的一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于:步骤g中当幼苗长出2-3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为10-15cm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。5.根据权利要求3所述的一种高遗传多样性且高成胚成苗率小麦的合成方法，其特征在于:步骤g中当幼苗长出2-3个分蘖时，在幼苗植株一侧挖一直径为10-15cm的小坑，露出12的根系，露出的根系在清除泥土后放入一个直径IOcm的小烧杯中，然后用吸移管注入浓度为1%的秋水仙素溶液直至没过根系，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖，8小时后，去掉烧杯和剩余的秋水仙素溶液，将根系至分蘖节轻轻重埋土中；两周后，重复上述步骤处理另一侧的根系，随后继续进行田间培养管理直至收获。

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