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申请/专利权人：山东农业大学

摘要：本发明提供了小麦基因Yr10分子标记及其在抗小麦条锈病中的应用，属于小麦育种技术领域。小麦基因Yr10分子标记，其特征在于，所述Yr10分子标记具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。所述分子标记与小麦抗条锈病基因Yr10完全连锁，命名为Xsdau79。通过检测所述分子标记能够得到小麦基因Yr10是否存在，从而确定小麦品种是否具有抗条锈病的特点。本发明提供的分子标记能够准确、快速的鉴定抗条锈病基因Yr10，因此本发明提供了所述的引物在筛选抗条锈病小麦中的应用。

主权项：1.筛选条锈病的小麦基因Yr10分子标记，其特征在于，所述小麦基因Yr10分子标记的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

全文数据：小麦基因YMO分子标记及其在筛选抗小麦条锈病小麦中的应用技术领域[0001]本发明属于小麦育种技术领域，具体涉及小麦基因YrlO分子标记及其在筛选抗小麦条锈病小麦中的应用。背景技术[0002]小麦TriticumaestivumL.是我国第二大粮食作物，常年种植面积2400万公顷以上，总产量约1.2亿吨，占粮食作物产量的20%。因此，小麦生产对于我国粮食安全以及经济发展具有重要作用。[0003]小麦条锈病由条形柄锈菌Pucciniastriiformisf.sp·tritici，Pst引起，主要发生在小麦叶片部位，其次危害小麦叶鞘和茎杆，偶尔蔓延到穗部颖壳和麦芒。小麦条锈病菌喜凉怕热，在凉爽的气候条件下保持活性并繁殖，主要依赖夏孢子往返传播，在小麦上完成周年的侵染循环。菌丝生长和产孢需要从小麦体内汲取水分和营养，影响叶片的光合能力，导致小麦减产。小麦条锈病是一种典型的气传病害可随高空气流远距离传播，在全球多数麦区均有发生，流行性强、发生区域广、危害性大。另外，小麦条锈菌变异速度快，频繁形成新的小种，导致小麦品种的抗病性丧失。我国是小麦生产大国，小麦条锈病的发生普遍，常导致小麦的大幅度减产，严重威胁着我国的粮食安全。[0004]化学杀菌剂的使用是防治小麦条锈病危害的重要方法。比如农药代森锌、氟钡化合物、六氟硅酸二钠、磺胺吡啶酸钠、磺胺吡啶酸和波尔多混合液等来控制小麦条锈病的蔓延，对防治小麦条锈病起到了一定作用，但增加了小麦生产成本，加重了环境负担。[0005]培育和应用新的抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效、安全的方法。只有实现小麦品种抗病基因使用的多样化，小麦条锈菌的变异和流行才可能被抑制。利用分子标记开展辅助选择，实现多个抗病基因的聚合，对于培育持久抗病品种具有重要作用。[0006]小麦抗条锈病基因YrlO基因发现于土耳其小麦PI78383,具有小麦全生育期抗条锈性，对我国目前流行的几乎所有条锈小种都呈现抗性，具有重要的利用价值。该基因定位于小麦IBS染色体，并且已有前人报道NBS-LRR基因（Genbank登录号AF149113为YrlO基因。然而，我们发现我国许多携带该基因的小麦品种表现感病Yuanetal.，2012，而且通过基因定位发现该候选基因YrlOCGAF149113与YrlO位点相距1.2cM遗传距离。发明内容[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供小麦基因YrlO分子标记及其在筛选抗小麦条锈病小麦中的应用，所述分子标记具有快速、准确和高效的特点，辅助选择育种，大大提高育种效率。[0008]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0009]本发明提供了小麦基因YrlO分子标记，所述YrlO分子标记具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。[0010]本发明提供了用于扩增小麦基因YrlO分子标记的巢式PCR引物，由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括sdau79-lBF7和sdau79-lBR7;第二对引物包括WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R;[0011]所述sdau79-lBF7具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；[0012]所述sdau79-lBR7具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；[0013]所述WJZ104Xsdau79-F具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；[0014]所述WJZ104Xsdau79-R具有如序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。[0015]本发明提供了所述的引物在筛选抗条锈病小麦中的应用。[0016]在本发明中，所述筛选的方法，优选包括以下步骤：[0017]1提取待检测小麦材料的DNA;[0018]2以所述DNA为模板，用所述引物中的Sdau79-1BF7与Sdau79-1BR7进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物；[0019]3以所述第一轮PCR产物为模板，用所述引物中的WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；[0020]4将所述第二轮PCR产物进行电泳，若得到459bp的电泳条带，表明检测小麦材料为抗条锈病小麦品种。[0021]优选的，所述步骤2中第一轮PCR的反应程序为94°C预变性5min;94°C变性30s;60。:退火30s;72°C延伸lmin35s;38个循环；72°C延伸lOmin。[0022]优选的，所述步骤3中第二轮PCR的反应程序为94°C预变性5min;94°C变性30s;60。:退火30s;72°C延伸3〇8;38个循环；72°：延伸1〇11^11。[0023]优选的，所述步骤2和步骤3中PCR的反应体系独立为IOOngAxL的模板DNAlyL，2xMasterMix10yL，10ymolLsdau79-lBF7或WJZ104Xsdau79-FlyL，10ymolLsdau79-1BR7或WJZ104Xsdau79-RlyL，CldH2O7yL〇[0024]本发明提供了小麦基因YrlO分子标记，所述基因YrlO分子标记具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本发明提供的分子标记与之前报道的YrlOCGAF149113相距1.2cM，而与真正的YrlO位点紧密连锁。因此，将该标记用于YrlO基因的分子标记辅助选择育种可显著提高选择效率。[0025]本发明提供了用于扩增小麦基因YrlO分子标记的巢式PCR引物，两对引物具有扩增特异性高的特点，能够准确扩增得到所述基因YrlO分子标记。[0026]本发明提供了所述的引物在筛选抗条锈病小麦中的应用。采用巢式PCR法筛选抗条锈病小麦，阳性植株即含有YrlO基因的小麦材料为459bp大小的电泳带。阴性植株即不含有YrlO基因的小麦材料为512bp大小的电泳带。通过电泳条带能够准确快速筛选抗条锈病小麦材料。附图说明[0027]图1为实施例1中Yr10基因定位群体中24个个体的基因型；[0028]图2为实施例1中YrlO基因定位群体中的表型图；[0029]图3为实施例1中YrlO基因的遗传连锁图谱；[0030]图4为实施例2中小麦基因YrlO分子标记PCR扩增电泳图。具体实施方式[0031]本发明提供了本发明提供了小麦基因YrlO分子标记，所述YrlO分子标记具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。[0032]在本发明中，所述小麦基因YrlO分子标记与小麦基因YrlO完全连锁，保证了检测的准确性。[0033]本发明提供了用于扩增小麦基因YrlO分子标记的巢式PCR引物，由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括sdau79-lBF7和sdau79-lBR7;第二对引物包括WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R;[0034]所述sdau79-lBF7具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；[0035]所述sdau79-lBR7具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；[0036]所述WJZ104Xsdau79-F具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；[0037]所述WJZ104Xsdau79-R具有如序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。[0038]在本发明中，所述第一对引物和第二对引物的来源没有特殊限制，委托本领域所熟知的序列合成公司合成即可。[0039]本发明提供了上述技术方案所述的引物在筛选抗条锈病小麦中的应用。[0040]在本发明中，所述筛选的方法，优选包括以下步骤：[0041]1提取待检测小麦材料的DNA;[0042]2以所述DNA为模板，用所述引物中的sdau79-lBF7与sdau79-lBR7进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物；[0043]3以所述第一轮PCR产物为模板，用所述引物中的WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；[0044]4将所述第二轮PCR产物进行电泳，若459bp的电泳条带，表明检测小麦材料为抗条锈病小麦品种。[0045]本发明提取待检测小麦材料的DNA。[0046]在本发明中，所述提取DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可。[0047]提取DNA后，本发明优选将提取的DNA进行电泳检测。所述电泳检测的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因组DNA检测方法即可。经检测，条带整齐且亮度高的DNA为要求合格的DNA，用于后续试验。[0048]得到合格DNA后，本发明以所述合格的DNA为模板，用所述引物sdau79-lBF7与sdau79-lBR7进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物。[0049]在本发明中，所述第一轮PCR的反应程序优选为:94°C预变性5min;94°C变性30s;60°C退火30s;72°C延伸lmin35s;38个循环；72°C延伸lOmin。[0050]在本发明中，所述第一轮PCR的反应体系优选为：100ngyL的模板DNAlyL，2xMasterMixIOyL,10ymolLsdau79-lBF71yL,10ymolLsdau79-lBR71yL,ddH2〇7yL〇[0051]在本发明中，所述PCR反应用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR反应用仪器即可。[0052]第一轮PCR产物后，本发明以所述第一轮PCR产物为模板，用所述的引物WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物。[0053]在本发明中，所述第二轮PCR的反应程序优选为:94°C预变性5min;94°C变性30s;60°C退火30s;72°C延伸3〇8;38个循环；72°：延伸1〇11^11。[0054]在本发明中，所述第二轮PCR的反应体系优选为：100ngyL的模板DNAlyL，2xMasterMix10yLa〇ymolLWJZ104Xsdau79-FlyL,l〇ymolLWJZ104Xsdau79-R1μL，ddH2〇7yL。[0055]第二轮PCR产物后，本发明将所述第二轮PCR产物进行电泳，得到459bp的电泳条带表明检测小麦材料为抗条锈病小麦品种。[0056]在本发明中，所述电泳的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的电泳方法即可。[0057]电泳结束后，本发明优选将电泳后的胶块染色后在凝胶成像仪下观察拍照。结果图4所示。阳性植株即含有Yr10基因的小麦材料为459bp大小的电泳带。阴性植株为不含有Yr10基因的小麦材料为512bp大小的电泳带。[0058]下面结合实施例对本发明提供的小麦基因Yr10分子标记及其在抗小麦条锈病中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0059]实施例1[0060]Yr10基因的遗传作图与精细定位。利用携带Yr10基因的小麦品种Moro与感病品种辉县红杂交创建分离群体，筛选抗病、感病呈现3:1分离的两个F3代家系F2-7和F2-51开展基因定位。两个家系分别编号为P〇p858株和PoplO81株亚群体，利用其中35个抗病性分离的株系获得7，500株后代材料F4构成精细定位群体Popl1。[0061]植物材料的表型鉴定均采用田间注射接菌法。将-20°C存放的孢子取出，准备适量水，将孢子混入水中并摇晃至孢子水悬浮液变成淡橙色，将孢子水悬浮液至于22°C，ISOrpm摇床上震荡混匀30min，用于注射接菌。在三月中下旬大田小麦起身期注射小麦茎杆，注射后大约20天可以看到零星发病，大约30天后大量发病。小麦发病后植株抗病性鉴定采用0-9级鉴定方法Lineetal·，1991进行抗病性评价。[0062]为开发分子标记，TRIAE_CS42_1BS_TGACv1_049371_AA0150980基因在Moro、辉县红间的DNA序列多态性，设计了PCR标记Xsdau77。该标记序列如序列表中SEQIDNo.6所示。PCR标记Xsdau77的引物序列分别如序列表中SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示。通过遗传图谱可知该标记与YrlO基因的遗传距离为11.lcM。[0063]为找到更近的分子标记，利用小麦基因（TRIAE_CS42_lBS_TGACvl_049347_AAO149810在Moro、辉县红间的DNA序列多态性，设计了PCR标记Xsdau79。该标记即为本发明所描述的分子标记，标记序列如序列表中SEQIDNo.1所示，该标记由第一对引物和第二对引物组成，第一对引物包括sdau79-lBF7和sdau79-lBR7;第二对引物包括WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R。sdau79-lBF7具有如序列表中SEQIDNo·2所示的核苷酸序列；sdau79-lBR7具有如序列表中SEQID如.3所示的核苷酸序列;胃瓜104^8^1179-卩具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列;WJZ104Xsdau79-R具有如序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。通过遗传图谱可知该标记与YrlO基因完全连锁。[0064]将开发的分子标记用于定位群体筛选，在群体中选择24个个体基因型如图1所示，在1-24号个体中，编号4、10、17、23为分子标记乂811179位点纯合的阳性植株;编号1-3、5-9、12-16、18-20为分子标记乂811179位点杂合的阳性植株;编号11、21、22、24为阴性植株。条锈病抗性表型鉴定如图2所示，分子标记Xsdau79位点纯合或杂合的阳性植株表现抗病，而分子标记Xsdau79位点为阴性的植株表现感病。[0065]作图结果如图3所示，已报道位点YrIOcgAF149113与Yr10基因相距1.2cM，已知的分子标记位点Xpsp3000标记与YrlO相距3.8cM。本发明中开发的分子标记Xsdau79与YrlO基因完全连锁;分子标记Xsdau77与YrlO相距11.lcM。[0066]实施例2[0067]1、材料的选择:本实施案例中采用的植株材料为含有小麦抗条锈病Yr10基因的小麦品种Moro，不含有小麦抗条锈病YrlO基因的小麦品种辉县红，以及杂交F1代植株，最后以CldH2O作为空白对照。[0068]2、小麦基因组DNA提取，具体方法如下：[0069]利用SDS法提取待检测小麦基因组DNA:[0070]1取新鲜叶片或_80°C超低温保存的叶片，放入2mL离心管中，迅速置于液氮中；[0071]⑵将⑴中材料迅速碾磨成粉末，加入DNA提取液800yL，震荡混匀；[0072]3加入5yL浓度为10mgmL的RNaseA，在37°C水浴锅中温浴30min，其间上下翻转混匀；[0073]4加入SOOyL苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液苯酚、氯仿和异戊醇的比例为25:24:1，充分震荡混匀，12，OOOrpm离心IOmin;[0074]5吸取650yL上清液至新的2mL离心管中，加入650yL氯仿，充分混匀，12，OOOrpm离心IOmin;[0075]⑹转移450yL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入45yL3molL醋酸钠溶液和450yL异丙醇，轻轻翻转混勾。此时将会有DNA絮状沉淀析出，用灭菌的黄色枪头挑出DNA沉淀，用75%乙醇漂洗2次，将DNA放入干净的1.5mL离心管中风干；[0076]7向⑹中含DNA的离心管中加入200yLlXTE溶液，用枪头轻轻吸打DNA使其充分溶解；[0077]⑻取IyLDNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测所提取DNA的浓度和质量。将样品放在-20°C或-80°C冰箱中，保存备用。[0078]3、引物稀释：[0079]将2对引物用超纯水稀释到1ΟμπιοIL，保存至-20°C备用。[0080]4、PCR扩增体系和程序如下：[0081]20yLPCR体系配制[0082]依表1在冰上配制体系。[0083]表1反应体系组成[0086]备注:Mix可用；或（Taq酶0·25yL，dNTP2yL，Bufferl·5yL，MgCl2O·4yL配置。）[0087]配置好PCR体系后，在PCR仪ABI9700上进行PCR扩增。[0088]第一轮PCR使用引物为sdau79-lBF7与sdau79-lBR7〇[0089]反应程序如下：[0090]94。：预变性511^11;[0091]94Γ变性30s;[0092]60Γ退火30s;[0093]72。：延伸111^11358;38个循环；[0094]72Γ延伸IOmin;[0095]4Γ保存。[0096]第一轮PCR产物为1652bp单一条带，将第一轮PCR产物3yL加180yL水作为第二轮PCR反应模板DNA，进行第二轮PCR反应，反应体系如上所述。[0097]第二轮PCR使用引物为WJZ104Xsdau79-F与WJZ105Xsdau79-R。反应程序如下：[0098]1.94。：预变性511^11;[0099]2.94Γ变性30s;[0100]3.6TC退火30s;[0101]4.72Γ延伸30s;38个循环；[0102]5.72Γ延伸IOmin;[0103]6.4Γ保存。[0104]通过第二轮PCR扩增，可获得目标产物，阳性植株为459bp大小的片段，阴性植株为512bp的片段。[0105]5、结果分析：[0106]将上述第二轮PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳分离后，结果见图4。携带YrlO基因的小麦品种Moro具有条锈病抗性，扩增产物为459bp大小的电泳带;Moro辉县红杂交的Fl代杂交种，具有条锈病抗性，扩增产物为459bp与512bp大小的两条电泳带;不含有YrlO基因的小麦品种辉县红，不具有条锈病抗性，扩增产物为512bp大小的电泳带。[0107]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.小麦基因YrlO分子标记，其特征在于，所述YrlO分子标记具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.用于扩增小麦基因YrlO分子标记的巢式PCR引物，由第一对引物和第二对引物组成，其特征在于，第一对引物包括sdau79-lBF7和sdau79-lBR7;第二对引物包括WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R;所述sdau79-lBF7具有如序列表中SEQIDN0.2所示的核苷酸序列；所述sdau79-lBR7具有如序列表中SEQIDN0.3所示的核苷酸序列；所述WJZ104Xsdau79-F具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；所述WJZ104Xsdau79-R具有如序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。3.权利要求2所述的引物在筛选抗条锈病小麦中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述筛选的方法，包括以下步骤：1提取待检测小麦材料的DNA;2以所述DNA为模板，用权利要求2所述引物中的sdau79-lBF7与sdau79-lBR7进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物；3以所述第一轮PCR产物为模板，用权利要求2所述引物中的WJZ104Xsdau79-F和WJZ104Xsdau79-R进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；4将所述第二轮PCR产物进行电泳，若得到459bp的电泳条带，则表明检测小麦材料为抗条锈病小麦品种。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤2中第一轮PCR的反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性30s;60°C退火30s;72°C延伸lmin35s;38个循环；72°C延伸lOmin。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤3中第二轮PCR的反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性30s;60°C退火30s;72°C延伸30s;38个循环；72°C延伸lOmin。7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤2和步骤3中PCR的反应体系独立为：100ngyL的模板DNAlyL，2xMasterMix10yL，10ymolLsdau79-lBF7或WJZ104Xsdau79-FlyL，10ymolLsdau79-lBR7或WJZ104Xsdau79-RlyL，CldH2O7yL〇

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