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申请/专利权人：中国科学院南海海洋研究所

摘要：本发明公开了一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST‑SSR引物和鉴定方法。所述的EST‑SSR引物Ch513为：F:5’‑CTGGAATCGGTATGTCTT‑3’；R:5’‑GTTACGTGCACCCTAAAT‑3’。利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出香港牡蛎、熊本牡蛎、香港牡蛎×熊本牡蛎杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

主权项：1.鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物Ch513，其特征在于，所述的EST-SSR引物Ch513为：F:5’-CTGGAATCGGTATGTCTT-3’；R:5’-GTTACGTGCACCCTAAAT-3’。

全文数据：一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物和鉴定方法技术领域：[0001]本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和杂交种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物和鉴定方法。背景技术：[0002]牡蛎肉味鲜美，营养丰富，其养殖历史已有2000多年。由于较高的经济价值，牡蛎是目前中国乃至世界养殖产量最高的经济贝类。近年来，随着我国牡蛎养殖规模的不断扩大，在种苗繁育及养成过程中出现了生长缓慢、抗病抗逆性差等问题，培育优良新品种已成为促进我国牡蛎养殖业健康持续发展的关键因素。种间杂交是水产经济动物遗传改良的重要手段，具有杂种优势的后代往往在生长、生殖力、抗逆性、产量和品质等方面比亲本的一方或双方优越。[0003]香港牡蛎Crassostreahongkongensis又称白蛇，主要分布在我国广东、广西两省，喜好高温、低盐环境，是我国南方养殖的主要经济种，年产量在130万吨左右，具有生长快、个体肥大等优点。熊本牡蛎C.sikamea，主产于日本、中国和韩国，在我国分布于江苏南通以南，主要包括浙江、福建、广东、广西、海南等地，浙江为核心分布区；喜好高温、中高盐环境，但个体相对较小，均为野生状态，基本无养殖；由于其味道鲜美，这种牡蛎在国外市场上深受到广大销售者青睐，其价格是长牡蛎和美洲牡蛎1.5〜2倍。针对这两种牡蛎在生长、肉质等方面的特点，本课题组进行了香港牡蛎和熊本牡蛎的种间杂交育种试验并获得成功，发现香港牡蛎X熊本牡蛎杂交子代的生长性状比熊本牡蛎对照组都有了明显提高，为下一步牡蛎新品种培育奠定了良好的基础。发明内容：[0004]本发明目的在于提供一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物和鉴定方法。本发明利用该方法对香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代各90个个体进行了分析并发现鉴定效果显著。[0005]本发明从80对香港牡販EST-SSR引物中幸运的筛选出1对微卫星（SSI?引物，其对香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代各90个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效的对真正杂交子一代进行分子鉴定，从而简单高效地对香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。[0006]本发明的第一目的是提供鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物Ch513，其特征在于，所述的EST-SSR引物Ch513为：[0007]F:5’-CTGGAATCGGTATGTCTT-3’（其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示）；[0008]1?:5’-6117^6丁6〇八〇：〇7^1'-3’（其核苷酸序列如8£010^.2所示）。[0009]本发明的第二个目的是提供一种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的试剂盒，其特征在于，含有上述EST-SSR引物Ch513。[0010]本发明的第三个目的是提供一种香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：[0011]提取待测牡蛎样品的基因组DNA，然后用上述EST-SSR引物Ch513进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在260bp〜290bp区间内出现1〜2条条带，则待测牡蛎样品为香港牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子;若在230bp〜250bp区间内出现1〜2条条带，则待测牡蛎样品为熊本牡蛎，出现丨条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；当同时在26〇bp〜290bp区间和230bp〜250bp区间内各出现1条带，则待测牡蛎样品为香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。_2]优选，所述的用上述EST—SSR引物chs丨3进行pcR扩增，其pcR扩增体系为:25此，其中各种成分及终浓度分别为:DNA模板50ng，Buffer10mM，引物各0.2mM，dNTP0.2mM，Mg2+2•OmM，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25此。[0013]优选，所述的用上述EST-SSR引物Ch513进行PCR扩增，其PCR反应程序为:94。：预变性5min;94°C变性3〇s，55°C退火3〇s，72°C延伸lmin，重复30次;72。：延伸lOmin。[0014]优选，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳4小时，然后用〇•l%AgN03溶液（AgN03lg，dH20lOOOmL染色1Omin，银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、〇•2%NaS2〇3、dH201OOOmL显色，至条带清晰为止。[0015]由于EST-SSR引物Ch513产生的香港牡蛎特异条带范围在260bp〜290bp之间，熊本牡蛎特异性条带范围在230bp〜25〇bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种牡蛎的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比:若在260bp〜290bp区间内出现1〜2条条带，则该DNA样品为香港牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子;若在230bp〜250bp区间内出现1〜2条条带，则该DNA样品为熊本牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。该标记在香港牡蛎X熊本牡蛎杂交子一代鉴定中的应用方法为:样品只有同时在260bp〜29〇bp区间和230bp〜250bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。[0016]本发明从80对香港牡蛎EST-SSR引物中筛选出一对能够在香港牡蛎、熊本牡蛎中通用并且可以根据扩增条带大小区分两种牡蛎，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物:Ch513,并在两者间的杂交子一代个体鉴定中具有重要应用价值。[0017]由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的牡蛎根据形态特征更加难以区分。而利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出香港牡蛎、熊本牡蛎、香港牡蛎X熊本牡蛎杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。附图说明：[0018]图1为EST-SSR引物Ch513在香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代部分个体间的电泳染色对比图谱，1〜7是香港牡蛎个体，8〜14是熊本牡蛎个体，I5〜25是香港牡蛎x熊本牡蛎杂交子一代。具体实施方式：[0019]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。[0020]实施例1:[0021]参见图1，采用酚-氯仿抽提法提取香港牡蛎、熊本牡蛎及香港牡蛎X熊本牡蛎杂交子一代各90个个体的基因组DNA。将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1•5mL离心管中，再加入400yl裂解液和lOiil蛋白酶K10mgml，在振荡器上混匀，55°C水浴消化3〜5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚2〇〇uL、氯仿异戊醇24:1200UL混合液抽提三次。用ltnL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾千后溶于100此的超纯水中，得到各个体的基因组DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。以提取的三种牡蛎基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应:PCR反应体系的总体积为25uL，其中各种成分及终浓度分别为:DNA模板50ng，Buffer10mM，引物各0.2mM，dNTP0.2mM，Mg2+2.0Mm，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25uL。其中引物序列EST-SSR引物Ch513为：[0022]F:5,-CTGGAATCGGTATGTCTT-3,；[0023]R:5’-GTTACGTGCACCCTAAAT-3’；[0024]反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，变性至延伸三个步骤重复30次，72°C延伸lOmin。[0025]PCR反应结束后，取〇_5uL扩增产物在8°乂非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入〇_l%AgN〇3溶液AgN〇3lg，dH2〇lOOOmL染色lOmin。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液（2%NaOH、0_4%甲醛、0.2%NaS2〇3、dH201OOOmL显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描伩下扫描后，扫描图如图丨所示：[0026]由于EST-SSR引物Ch513产生的香港牡蛎特异条带范围在260bp〜290bp之间，熊本牡蛎特异性条带范围在230bp〜250bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种牡蛎的个体。因此将电泳结果与标准图谱进行对比：若在26〇bp〜290bp区间内出现1〜2条条带，则该DNA样品为香港牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子;若在23〇bp〜25〇bp区间内出现1〜2条条带，则该DNA样品为熊本牡蛎，出现^条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。该标记在香港牡蛎xji本牡蛎杂交子一代鉴定中的应用方法为:样品只有同时在26〇bp〜29〇bp区间和23〇bp〜2^bP区间内各出现丨条带，即同时拥有亲本的丨条特异性条带的个体才为真正的香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。

权利要求：1.鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的EST-SSR引物Ch513,其特征在于，所述的EST-SSR引物Ch513为：F:5，_CTGGAATCGGTATGTCTT-3’；R:5’-GTTACGTGCACCCTMAT-3’。2.—种鉴定香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的EST-SSR引物Ch513。3.—种香港牡蛎、熊本牡蛎及其杂交子一代的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测牡蛎样品的基因组DNA，然后用权利要求1所述的EST-SSR引物Ch513进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在260bp〜290bp区间内出现1〜2条条带，则待测牡蛎样品为香港牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在230bp〜250bp区间内出现1〜2条条带，则待测牡蛎样品为熊本牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；当同时在260bp〜290bp区间和230bp〜250bp区间内各出现1条带，则待测牡蛎样品为香港牡蛎与熊本牡蛎杂交子一代。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用EST-SSR引物Ch513进行PCR扩增，其PCR扩增体系为:25此，其中各种成分及终浓度分别为:DNA模板50ng，Buffer10mM，引物各〇.2mM，dNTP0.2mM，Mg2+2.0mM，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25uL。5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用EST-SSR引物Ch513进行PCR扩增，其PCR反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，重复30次;72°C延伸lOmin。6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22〇V稳压电泳4小时，然后用0_l%AgNO3溶液染色lOmin，银染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0_2%NaS2〇3、dH2〇1000mL显色，至条带清晰为止。

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