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申请/专利权人：浙江师范大学;上海财经大学浙江学院

摘要：本发明涉及一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用，所述多重PCR引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的第一引物对，以及包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的第二引物对。所述鉴定方法包括：提取待鉴定样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板DNA，采用所述的多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据扩增条带分析结果，若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时，则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。该鉴定方法准确度高，且检测时间短、操作简便，经济实用。

主权项：1.一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的第一引物对，以及包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的第二引物对。

全文数据：用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用技术领域本发明涉及生物物种的检测领域，特别是涉及用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用。背景技术义乌小鲵Hynobiusyiwuensis隶属于两栖纲、有尾目、小鲵科、小鲵属，于1985年被发现，目前仅见于浙江省少数地区，数量不多，为中国特有的稀有两栖动物之一。义乌小鲵早在恐龙出现之前就已存在，至今在地球上已经生活了3亿多年，无疑又是一种“活化石”。研究义乌小鲵在有尾两栖动物的分类地位及其地理分布现状，对深入探讨两栖动物的演化有较大的意义。然而，随着人类活动的影响，义乌小鲵的种群数量也随之逐年减少。目前，该物种已被入列中国国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》以及2013年发布的《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》。如果不及时加以保护，义乌小鲵很可能在人类完全认知它们之前就已经灭绝。所以，义乌小鲵的物种鉴定成为人类认知义乌小鲵和可持续发展的必要前提。发明内容基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用，所述多重PCR引物可准确鉴定出义乌小鲵，且检测时间短、操作简便。一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物，所述多重PCR引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的第一引物对，以及包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的第二引物对。一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR试剂盒，包括所述的多重PCR引物。在其中一个实施例中，所述多重PCR试剂盒还包括10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水中的至少一种。在其中一个实施例中，所述多重PCR试剂盒还包括模板DNA，所述模板DNA为义乌小鲵的基因组DNA。一种鉴定义乌小鲵的方法，包括：提取待鉴定样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板DNA，采用所述的多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据扩增条带分析结果，若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时，则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。在其中一个实施例中，采用所述多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增时，PCR反应体系的体积为10μL～50μL，包括1.5mmolL～3.0mmolL的MgCl2，0.10mmolL～0.40mmolL的dNTP，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第一引物对，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第二引物对，0.5U～1.5U的Taq聚合酶，0.1μL～2μL的所述模板DNA，1μL～5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。在其中一个实施例中，所述PCR扩增的反应过程包括预变性，所述预变性的温度为94℃～98℃，时间为2min～5min。在其中一个实施例中，在所述预变性之后，依次进行变性、退火和延伸，循环25次～40次，其中，所述变性的温度为94℃～98℃、时间为10s～40s，所述退火的温度为50℃～63℃、时间为20s～45s，所述延伸的温度为68℃～72℃、时间为20s～60s。在其中一个实施例中，在变性、退火和延伸的循环结束之后，还在72℃延伸3min～10min。一种所述的多重PCR引物或所述的方法在鉴定义乌小鲵中的应用。本发明的多重PCR引物可用于对提取的基因组DNA进行PCR扩增，然后将扩增产物进行凝胶电泳，通过凝胶电泳的检测结果判定所提取的基因组DNA是否来源于义乌小鲵，准确度高，且检测时间短、操作简便，经济实用。附图说明图1为本发明实施例1的义乌小鲵成体多重PCR分子鉴定方法的特异性检测结果；图2为本发明实施例2的义乌小鲵幼体多重PCR鉴定方法的检测结果；图3为本发明实施例3的义乌小鲵卵粒多重PCR鉴定方法的检测结果；图4为本发明实施例4的义乌小鲵环境水样多重PCR鉴定方法的检测结果。具体实施方式以下将对本发明提供的用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用作进一步说明。本发明从GenBank数据库中下载了义乌小鲵及其与义乌小鲵同域分布的一系列两栖类物种的线粒体细胞色素bcytb基因序列和细胞色素氧化酶ICOI基因序列，包括：义乌小鲵、安吉小鲵、镇海棘螈、中国瘰螈、东方蝾螈、秉志肥螈、花臭蛙、花姬蛙、华南湍蛙、镇海林蛙、中华大蟾蜍、福建大头蛙、淡肩角蟾、黑斑蛙和泽陆蛙共15个物种的30个基因序列，通过ClustalX软件进行序列比对，寻找义乌小鲵与其它物种在cytb基因和COI基因上差异相对较大的序列，然后从GenBank数据库中的义乌小鲵线粒体全序列登录号HM036354中筛选出cytb和COI基因的完整序列，并以此为参考序列进行义乌小鲵特异性引物设计。以cytb基因的350～450位点的高变序列区间作为cytb基因上游引物的备择设计区间，以750～850位点的高变序列区间作为该基因下游引物的备择设计区间；以COI基因的250～350位点的高变序列区间作为COI基因上游引物的备择设计区间，以1150～1250位点的高变序列区间作为该基因下游引物的备择设计区间，利用Primerpremier5.0软件设计能对义乌小鲵进行扩增的两对特异性引物。所以，本发明提供的用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物，包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的第一引物对，以及包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的第二引物对。其中，第一引物对的SEQIDNO.1具体为：上游引物Hyi_F1:5’GGCGCCCCAGATATAGCATT3’；第一引物对的SEQIDNO.2具体为：下游引物Hyi_R1:5’AATGGCAAATACAGCCCCCA3’。第二引物对的SEQIDNO.3具体为：上游引物Hyi_F2:5’TAGCAACTGCCTTTGTCGGG3’；第二引物对的SEQIDNO.4具体为：下游引物Hyi_R2:5’CTAATGGGTTGGCTGGGGTG3’。本发明还提供一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR试剂盒，包括所述的多重PCR引物，以及10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水中的至少一种。在使用时，可根据需要直接利用PCR试剂盒中的试剂配置形成相应浓度的PCR反应体系，进行PCR扩增和凝胶电泳检测。优选的，所述多重PCR试剂盒中还包括有模板DNA，所述模板DNA为义乌小鲵的基因组DNA，可用于做对照实验。本发明还提供一种鉴定义乌小鲵的方法，包括：S1，提取待鉴定样品的基因组DNA；S2，以所述基因组DNA为模板DNA，采用所述的多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；S3，将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据扩增条带分析结果，若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时，则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。步骤S1中，待鉴定样品的基因组DNA可通过动物基因组DNA抽提试剂盒从待鉴定样品的成体、幼体或卵粒中提取，也可通过水样DNA抽提试剂盒从待鉴定样品的成体、幼体或卵粒的生存环境水样中提取。步骤S2中，采用所述多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增时，PCR反应体系的体积为10μL～50μL，包括1.5mmolL～3.0mmolL的MgCl2，0.10mmolL～0.40mmolL的dNTP，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第一引物对，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第二引物对，0.5U～1.5U的Taq聚合酶，0.1μL～2μL的所述模板DNA，1μL～5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。其中，所述第一引物对和所述第二引物对在PCR反应体系中的浓度比为1:1～1:4。所述PCR扩增的反应过程包括预变性，所述预变性的温度为94℃～98℃，时间为2min～5min。在所述预变性之后，依次进行变性、退火和延伸，循环25次～40次，其中，所述变性的温度为94℃～98℃、时间为10s～40s，所述退火的温度为50℃～63℃、时间为20s～45s，所述延伸的温度为68℃～72℃、时间为20s～60s。在变性、退火和延伸的循环结束之后，还在72℃延伸3min～10min。步骤S3中，凝胶电泳的过程包括琼脂糖凝胶板的制备、电泳和鉴定检测。其中，琼脂糖凝胶板的制备包括：用分析天平称取0.4g～0.8g琼脂糖，加入到40mL0.5×TBE缓冲液中摇匀，微波炉加热90s使其完全溶解，将1μl～2μl的核酸染料加入溶液后混匀，放置中制胶板于胶槽中，插入适当齿数梳子，倒入溶液于胶槽中，室温冷却静置20min～40min，待凝固后，两边同时拔掉梳子，除去边缘多余凝胶，即制备得到1％～2％的比例的琼脂糖凝胶板。然后，将制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液使其覆盖于胶板上。开始加样，加入3μlDM2000DNAMarker，加入4μl待鉴定样品的扩增产物。然后按照一定恒定电压进行核酸电泳，电泳时间为10min～30min。最后，再通过凝胶成像系统，观察待鉴定样品的扩增产物的扩增条带，分析鉴定结果。若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时，则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。若扩增无条带或仅有一条带时，则判断所述待鉴定样品不是来自义乌小鲵的样品。所以，该鉴定方法准确度高，且检测时间短、操作简便，经济实用。本发明还提供一种根据所述的多重PCR引物或所述的方法在鉴定义乌小鲵中的应用，从而可以轻易鉴定出待鉴定样品是否为来自义乌小鲵的样品。以下，将通过以下具体实施例对所述用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用做进一步的说明。实施例1：用动物基因组DNA抽提试剂盒分别提取义乌小鲵、安吉小鲵、东方蝾螈、秉志肥螈、花臭蛙、华南湍蛙、镇海林蛙、淡肩角蟾、黑斑蛙和泽陆蛙的肌肉DNA。以所提取的各待测样品的肌肉DNA作为模板DNA，以无菌水为阴性对照样本，采用本发明的多重PCR引物分别对各模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。其中，PCR反应体系的体积为20μl，包括3.0mmolL的MgCl2，0.25mmolL的dNTP，0.05μmolL的第一引物对，0.2μmolL的第二引物对，1.0U的Taq聚合酶，模板DNA0.2μl，10×Buffer2μl，双蒸水补足到20μl。PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸3min。将上述所得到的扩增产物进行凝胶电泳，通过凝胶成像系统，观察各待测样品的肌肉DNA的扩增条带。如图1所示，图中M为分子量标准DNAMakerDM2000，图中数字1-5为义乌小鲵成体的肌肉DNA的扩增条带、6为安吉小鲵的肌肉DNA的扩增条带、7为东方蝾螈的肌肉DNA的扩增条带、8为秉志肥螈的肌肉DNA的扩增条带、9为花臭蛙的肌肉DNA的扩增条带、10为华南湍蛙的肌肉DNA的扩增条带、11为镇海林蛙的肌肉DNA的扩增条带、12为淡肩角蟾的肌肉DNA的扩增条带、13为黑斑蛙的肌肉DNA的扩增条带、14为泽陆蛙的肌肉DNA的扩增条带、15为无菌水作为模板的扩增条带。其中，两条扩增条带中，上面的条带为第一引物对Hyi_F1Hyi_R1的PCR扩增结果，下面的条带为第二引物对Hyi_F2Hyi_R2的PCR扩增结果。从图1可知，在以义乌小鲵的成体的肌肉DNA为模板的PCR扩增条带为906bp和417bp二条带，而在以安吉小鲵、东方蝾螈、秉志肥螈、花臭蛙、华南湍蛙、镇海林蛙、淡肩角蟾、黑斑蛙和泽陆蛙的肌肉DNA为模板的PCR扩增均无条带产生，在以无菌水作为模板的PCR扩增中无条带产生。从而证明本发明所建立的PCR检测方法有效。实施例2：根据实施例1所建立的义乌小鲵成体多重PCR鉴定方法，对3例义乌小鲵幼体进行鉴定，结果如图2所示。图2中，M为分子量标准DNAMakerDM2000，图中数字1～3为义乌小鲵幼体的扩增条带，4为义乌小鲵成体的扩增条带，5为无菌水的扩增条带。其中，两条扩增条带中，上面的条带为第一引物对Hyi_F1Hyi_R1的PCR扩增结果；下面的条带为第二引物对Hyi_F2Hyi_R2的PCR扩增结果。从图2可知，义乌小鲵幼体的基因组DNA的扩增产物可产生906bp和417bp的两条PCR扩增条带，且以义乌小鲵成体为模板DNA的阳性对照PCR出现了906bp和417bp的两条扩增带，以无菌水为模板的阴性对照PCR扩增无条带产生。证明本发明所建立的义乌小鲵多重PCR鉴定方法可在义乌小鲵幼体鉴定中得到真实可靠的鉴定结果，该鉴定方法科学有效。实施例3：根据实施例1所建立的义乌小鲵成体多重PCR鉴定方法，对3例义乌小鲵卵粒进行鉴定，结果如图3所示。图3中，M为分子量标准DNAMakerDM2000，图中数字1～3为义乌小鲵卵粒的扩增条带，4为义乌小鲵成体的扩增条带，5为无菌水的扩增条带。其中，两条扩增条带中，上面的条带为第一引物对Hyi_F1Hyi_R1的PCR扩增结果，下面的条带为第二引物对Hyi_F2Hyi_R2的PCR扩增结果。从图3可知，义乌小鲵卵粒的基因组DNA的扩增产物均可产生906bp和417bp的两条PCR扩增条带，且以义乌小鲵成体为模板DNA的阳性对照PCR出现了906bp和417bp的两条扩增带，以无菌水为模板的阴性对照PCR扩增无条带产生。证明本发明所建立的义乌小鲵多重PCR鉴定方法可在义乌小鲵卵粒鉴定中得到真实可靠的鉴定结果，该鉴定方法科学有效。实施例4：从浙江舟山有义乌小鲵成体或义乌小鲵幼体或义乌小鲵卵粒分布的水坑中采集义乌小鲵的环境水样5份，同时采集无义乌小鲵分布的环境水样5份。对10份水样用0.45μm的醋酸纤维膜进行过滤，然后用水样基因组DNA抽提试剂盒提取水样中的基因组DNA。同时设置无菌水为阴性对照样本，义乌小鲵成体肌肉DNA为阳性对照样本。根据实施例1所建立的义乌小鲵成体多重PCR鉴定方法，对12份待鉴定样品进行鉴定，其中，PCR反应体系中以所提取的各待测样品的水样DNA作为模板DNA，用量为1.0μl，结果如图4所示。图4中，M为分子量标准DNAMakerDM2000，图中数字1～2为义乌小鲵卵粒水样的扩增条带，3～4为义乌小鲵幼体水样的扩增条带，5为义乌小鲵成体水样的扩增条带，6～10为无义乌小鲵分布水样的扩增条带，11为义乌小鲵成体的扩增条带，12为无菌水的扩增条带。其中，两条扩增条带中，上面的条带为第一引物对Hyi_F1Hyi_R1的PCR扩增结果，下面的条带为第二引物对Hyi_F2Hyi_R2的PCR扩增结果。从图4可知，在5个有义乌小鲵分布的水坑中所获取的基因组DNA经PCR扩增后均有906bp和417bp的二条带生成，以义乌小鲵成体肌肉DNA为阳性对照的PCR扩增同样有906bp和417bp的二条带生成，但在无义乌小鲵分布水样和无菌水水样样本中均无扩增条带生成。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的第一引物对，以及包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的第二引物对。2.一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的多重PCR引物。3.根据权利要求2所述的用于鉴定义乌小鲵的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述多重PCR试剂盒还包括10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水中的至少一种。4.根据权利要求3所述的用于鉴定义乌小鲵的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述多重PCR试剂盒还包括模板DNA，所述模板DNA为义乌小鲵的基因组DNA。5.一种鉴定义乌小鲵的方法，其特征在于，包括：提取待鉴定样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板DNA，采用权利要求1所述的多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据扩增条带分析结果，若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时，则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。6.根据权利要求5所述的鉴定义乌小鲵的方法，其特征在于，采用所述多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增时，PCR反应体系的体积为10μL～50μL，包括1.5mmolL～3.0mmolL的MgCl2，0.10mmolL～0.40mmolL的dNTP，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第一引物对，0.05μmolL～0.40μmolL的所述第二引物对，0.5U～1.5U的Taq聚合酶，0.1μL～2μL的所述模板DNA，1μL～5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。7.根据权利要求5所述的鉴定义乌小鲵的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应过程包括预变性，所述预变性的温度为94℃～98℃，时间为2min～5min。8.根据权利要求7所述的鉴定义乌小鲵的方法，其特征在于，在所述预变性之后，依次进行变性、退火和延伸，循环25次～40次，其中，所述变性的温度为94℃～98℃、时间为10s～40s，所述退火的温度为50℃～63℃、时间为20s～45s，所述延伸的温度为68℃～72℃、时间为20s～60s。9.根据权利要求8所述的鉴定义乌小鲵的方法，其特征在于，在变性、退火和延伸的循环结束之后，还在72℃延伸3min～10min。10.一种根据权利要求1所述的多重PCR引物或权利要求5～9任一项所述的方法在鉴定义乌小鲵中的应用。

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