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申请/专利权人：建新公司

摘要：本文提供选择表达靶多肽的细胞的群体的方法。在一些方面中，本公开文本提供基于经转染的宿主细胞中可选择多肽的早期表达来分选并选择所述宿主细胞的群体的方法。在某些实施方案中，该分选是使用基于该可选择多肽的荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选进行。所述选择方法可进一步用于生成生产细胞的克隆群体，例如用于目标靶多肽的大规模制造。

主权项：1.一种产生表达靶多肽的生产细胞的群体的方法，该方法包括：a用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；b在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达该可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和c扩增经转染的宿主细胞的该子群体，由此产生表达该靶多肽的生产细胞的群体。

全文数据：用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离EPIC相关申请的交叉引用本申请主张2016年10月7日申请的美国临时专利申请案第62405,392号的权益，其全部内容是通过引用并入本文中。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交并且全文通过引用并入本文中的序列表。在2017年10月5日创建的所述ASCII副本命名为593804_SA9_179CPC_ST25.txt并且大小为15,363字节。背景技术选择生产细胞群体和细胞克隆的方法对于生物制品例如抗体和融合蛋白的制造是必不可少的。所述方法通常依赖于使用选择剂，例如甲氨蝶呤MTX或甲硫氨酸砜亚胺MSX，以偏向并扩大生物制品的生产。给予选择剂的方法可影响所选群体的生存力或生长速率，或可对克隆稳定性具有负面影响。所述基于药物的选择也可较费时，通常需要多轮选择以获得含有适于生物制品制造的克隆的群体。仍需要生成大细胞群体和克隆二者的快速可靠的方法，所述群体和克隆产生对宿主细胞的负面影响较小的高效价生物制品。发明内容在一些方面中，本公开文本提供选择表达靶多肽的细胞群体的方法。如本文所述，研发依赖于在群体转染后不久对群体进行分选的选择方法。因此，该方法的特征为针对经转染载体的早期可检测表达分离经转染细胞子群体的步骤。在某些实施方案中，该选择是基于可选择多肽的早期表达，所述可选择多肽与靶多肽不同并且在细胞表面上可检测。意外的是，发现本文所述方法比使用两轮MTX选择生成池的传统方法更快，并且比包括单轮MTX选择在内的传统MTX扩增生产力更高。本文所述方法可用于例如生成筛选目标多肽的细胞池例如在早期临床研发中和用于生成高效价克隆，其可用于产生小规模和大规模制造的目标多肽。因此，在一些方面中，本公开文本提供产生表达靶多肽的生产细胞群体的方法，该方法包含：a用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；b在转染后2到15天内，从经转染的宿主细胞分离表达可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和c扩增经转染的早期表达宿主细胞的子群体，由此产生生产细胞群体。在一些实施方案中，步骤b是在无药物选择培养基中进行。在一些实施方案中，步骤c是在无药物选择培养基中进行。在一些实施方案中，步骤b和步骤c各自在无药物选择培养基中进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包含从经扩增子群体分离靶多肽。在所提供任一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包含从经扩增子群体分离一个或多个经转染的单宿主细胞和培养该一个或多个经转染的单宿主细胞以产生该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体。在所提供任一种方法的一些实施方案中，与在步骤c获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体中的至少一个产生靶多肽产量的2倍到30倍提高。在所提供任一种方法的一些实施方案中，经历步骤b中的分离的经转染的宿主细胞含有80-120x106个细胞。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤b中的分离是在转染后不到6天进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤b中的分离是在转染后2天与4天之间进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤b中的分离是在转染后2天进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤b中的分离是在转染后3天进行。在所提供任一种方法的一些实施方案中，在步骤c中的扩增之前，经转染的宿主细胞的子群体含有0.5-6.0x106个细胞。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤c中的扩增进行4到31天。在所提供任一种方法的一些实施方案中，一个或多个载体中的第一载体对编码靶多肽的mRNA进行编码，并且一个或多个载体中的第二载体编码可选择多肽。在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码靶多肽的mRNA和编码可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。在所提供任一种方法的一些实施方案中，一个或多个载体中的第一载体对编码靶多肽的mRNA进行编码，并且一个或多个载体中的第二载体编码可选择多肽。在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码多个靶多肽的mRNA和编码多个可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。在所提供任一种方法的一些实施方案中，步骤b中的分离采用磁激活细胞分选MACS、荧光激活细胞分选FACS或ClonePix。在所提供任一种方法的一些实施方案中，可选择多肽是FACS可选择多肽并且步骤b中的分离采用FACS。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽和可选择多肽形成融合多肽。在所提供任一种方法的一些实施方案中，mRNA是多顺反子mRNA。在所提供任一种方法的一些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码可选择多肽的第一开放阅读框ORF和编码靶多肽的第二ORF，其中第一ORF位于第二ORF的5'。在所提供任一种方法的一些实施方案中，第一ORF具有非AUG起始密码子。在所提供任一种方法的一些实施方案中，第二ORF具有AUG起始密码子。在所提供任一种方法的一些实施方案中，非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。在所提供任一种方法的一些实施方案中，编码可选择多肽的ORF缺乏任何AUG序列。在所提供任一种方法的一些实施方案中，可选择多肽是CD52或CD59。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是治疗剂。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。在所提供任一种方法的一些实施方案中，靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。在所提供任一种方法的一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。本公开文本的其他方面涉及表达可选择多肽和靶多肽其可通过上文所述或本文中其他地方描述的任一种方法来获得的经转染的宿主细胞的克隆群体。附图说明图1A是描绘传统转染和选择与基于EPIC的转染和选择之间的比较的示意图。早期表达是指在转染后，在显著基因组整合之前的早期表达。图1B是显示核苷酸缺乏选择过程中第3天到第21天的经转染的细胞群体的报道基因表达的图式与模拟转染的群体相比。经转染的细胞在转染后不久展现明显早期表达例如，第3-4天，并且随后在选择完成后过渡到稳定表达第18-21天。图2是一系列FACS直方图偏移，描绘来自相同载体pGZ729-RFP的红色荧光蛋白RFP和细胞表面报道基因CD52表达二者的早期表达。未对经转染的细胞施加选择压力。RFP和CD52的峰值早期表达出现在第2天与第3天之间。图3是一系列FACS直方图偏移，描绘在经pGZ729-RFP编码可选择多肽CD52和靶多肽RFP二者或pGZ700-RFP仅编码靶多肽RFP转染的细胞中RFP和CD52的第3天早期表达。图4是示意图，同时显示在转染后不久生成细胞子群体以供进行选择的EPIC方法，以及在分选富集的群体的分离扩增后对报道基因表达和单克隆抗体mAb效价二者的有益效应。模拟是指模拟转染。图5是描绘与传统MTX方法相比，EPIC生成的池的第14天未给料分批效价的图表。还显示通过快速增量工序生成的池RB#1和RB#2。图6是描绘来自EPIC生成的克隆的第14天未给料分批效价的图表，其实现1.5-2.0gL的最高表达。最左侧条形0.5gL代表在克隆前EPIC分选的池的效价。所有其他垂直条形代表各个克隆的效价。图7是一系列直方图偏移，描绘EPIC靶向以生成经pGZ729-RFP转染的稳定池的比较益处。使用EPIC靶向第2天的早期RFP表达，其产生与传统转染选择方法0nMMTX相比具有改良RFP和CD52报道基因表达的稳定池。图8是示意图，显示生成池以支持克隆有限稀释CLD工序的3种不同方法。所有方法都使用相似的“池化的”回收经转染细胞以开始该工序。EPIC和快速增量都是非MTX依赖性工序，也具有与传统MTX选择工序相比缩短的时间线。对三种重组蛋白mAb#1、mAb#2、FcFusion#1中的每一种完成此完整方案。图9是图表，其显示使用图8中显示的每一工序EPIC、快速增量和MTX生成的池的三种不同分子的克隆生产力。该图表图解说明，两种非MTX依赖性工序EPIC和快速增量都实现具有与从MTX选择工序产生的克隆类似的高生产力的克隆。图10是图解说明对于代表每种工序EPIC、快速增量和MTX的三种不同分子，每种工序从DNA到池和从池到克隆的时间线的图表。EPIC池生成可比MTX生成的池更快1个月地实现，此转换为对于克隆产生显著较短的总时间线。图11A是FACS直方图叠加，显示经分离以生成EPIC池的短暂阳性群体的可变分选靶与未分选对照相比。图11B是显示与每一EPIC分选靶相关的生产力，并明确显示，较高短暂靶向产生较高生产力。数据支持以下论断：EPIC池富集只是分离短暂阳性群体的结果。PoP＝原理验证具体实施方式在描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所公开的特定方法和实验条件；因为所述方法和条件可变。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，不打算具有限制性，因为本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。此外，除非另有指示，否则本发明的实践采用本领域技术内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。所述技术为熟练工作者所熟知，并且在文献中已充分解释。参见例如Ausubel等人编辑，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.1987-2008，包括所有增刊；M.R.Green和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual第四版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork2012；和Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual，第14章，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork2013，第2版。I.定义除非本文中另有定义，否则本文中所用的科学和技术术语具有本领域一般技术人员一般理解的含义。在任何潜在歧义的事件中，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和或”。术语“包括including”以及其他形式例如“包括includes”和“包括included”的使用是非限制性的。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语是本领域中熟知并且一般使用的术语。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术通常是根据本领域中熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行。酶反应和纯化方法是根据制造商说明书来进行，如本领域中一般所完成的或如本文所述。与在此所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗，使用标准技术。由此可更容易地理解本公开文本，所选术语定义于下文中。如本文所用，术语“多核苷酸”意指任何长度的核苷酸聚合形式，其例子包括但不限于基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNAmRNA、转移RNA、核糖体RNA、核酶、互补DNAcDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如本文所用，术语“多肽”意指任何长度的氨基酸的聚合形式，其例子包括但不限于蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体包括其片段和肽。如本文所用，“可选择多肽”是可通过任何适宜方法直接或间接检测的多肽，所述方法包括例如且不限于荧光激活细胞分选FACS、磁激活细胞分选MACS、ClonePix和亲和色谱。在某些实施方案中，可选择多肽在细胞表面上表达，也就是细胞表面多肽。可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽例如，CD52或CD59，其能结合到可检测结合配偶体例如，荧光标记抗体或由该配偶体结合。可选择多肽的其他例子包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP、黄色荧光蛋白YFP、蓝色荧光蛋白BFP和其变体，包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等。在某些实施方案中，可选择多肽可通过流式细胞术直接或间接地便捷地检测。如本文所用，“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指基于细胞表达的一种或多种FACS可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法。FACS依赖于各个细胞的光学性质包括荧光以将细胞分选为子群体。适于实施本文所述方法的FACS细胞分选器为本领域所熟知并且可在市场上购得。示例性FACS细胞分选器包括BDInfluxTMBDBiosciences和其他商业供货商生产的其他等效细胞分选器，其他商业供货商例如Sony、Bio-Rad和BeckmanCoulter。如本文所用，“FACS可选择多肽”是可通过流式细胞术直接或间接检测的多肽。FACS可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽例如，CD52或CD59，其能结合到可检测结合配偶体例如，荧光标记抗体用于通过流式细胞术间接检测多肽。FACS可选择多肽的其他例子包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP、黄色荧光蛋白YFP、蓝色荧光蛋白BFP和其变体，包括eGFP、Venus、mCherry、mTomato等，其可通过流式细胞术直接检测。如本文所用，磁激活细胞分选或“MACS”是指基于细胞表达的一种或多种MACS可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法。MACS依赖于加标签的各个细胞的磁敏感性性质，以将细胞分选为子群体。适于实施本文所述方法的MACS细胞分选器为本领域所熟知并且可在市场上购得。示例性MACS细胞分选器包括流式细胞仪MiltenyiBiotec。如本文所用，“MACS可选择多肽”是可通过磁激活细胞分选直接或间接检测的多肽。MACS可选择多肽的例子包括包含细胞外结构域的多肽例如，CD52或CD59，其能结合到磁敏感性结合配偶体例如，偶联到抗体的铁、镍或钴标记的珠粒用于直接或间接检测多肽。在某些实施方案中，可选择多肽可通过流式细胞术直接或间接地便捷地检测。如本文所用，“ClonePix”是指基于细胞表达的一种或多种可选择多肽的存在、不存在或水平将该细胞的群体分离为一个或多个子群体的方法和装置。ClonePix依赖于光学性质，包括各个细胞或细胞集落的白光和荧光检测，以将细胞分选为子群体。ClonePix描述于各自颁予Richmond等人的美国专利第7,776,584号；第8,034,612号；第8,034,625号；第8,293,520号；第8,293,525号；第8,293,526号；和第8,293,527号中，并且可从MolecularDevicesSunnyvale,CA购得。如本文所用，“靶多肽”是指可在宿主细胞中产生的蛋白质、蛋白质片段、多聚蛋白、融合蛋白、抗体包括其片段或肽，并且在本文所例示的方面中，靶多肽是由于其作为治疗剂的潜力而被选择，所述治疗剂例如抗体包括其片段、Fc融合蛋白、激素或酶。在一些实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。然而，对于治疗性多肽的选择和放大试验，本文所述方法不受限制。例如，还预期诊断性多肽或用于环境中的多肽用作本文所公开方法中的靶多肽。在某些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽，并且靶多肽是分泌多肽。如本文所用，术语“抗体”是指所述组合体例如，完整抗体分子、抗体片段或其变体其与目标抗原具有显著的已知特异性免疫反应活性。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，其间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已被相对充分地理解。如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体以及抗原结合片段和所述抗体的变体。抗体可为任何类别，例如IgG、IgA或IgM；并且为任何子类，例如IgG1或IgG4。抗体可为多克隆或单克隆抗体，或其可为多克隆或单克隆抗体的片段。抗体可为嵌合、人源化、完全人类、双特异性或双功能的。还预期抗体的任何抗原结合片段或变体，例如Fab、Fab'、Fab'2、单链可变区scFv和其变化形式。如本文所用，“Fc融合蛋白”是指包含直接或间接连接到多肽例如蛋白质或肽的免疫球蛋白Fc结构域的蛋白质。所连接多肽可为任何目标蛋白质性分子，例如配体、受体或抗原性肽。如本文所用，术语“生产细胞”是指表达目标多肽的细胞。在某些实施方案中，生产细胞是表达如本文所公开的靶多肽的细胞。在某些实施方案中，生产细胞是表达如本文所公开的可选择多肽和靶多肽二者的细胞。在某些实施方案中，术语“生产细胞”是指适于在例如生产生物制品的小规模或大规模制造方法中生产蛋白质的细胞。在一些实施方案中，生产细胞是哺乳动物或昆虫细胞。生产细胞进一步论述于本文中。如本文所用，“生产细胞的群体”是表达升高水平的一种或多种多肽的细胞的群体，所述多肽例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽。在某些实施方案中，“生产细胞的群体”是表达升高水平的靶多肽的细胞的群体。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中一种或多种多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中FACS可选择多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍，如通过流式细胞术例如，在BDInfluxTM细胞分选器上所检测。在一些实施方案中，该升高水平为未经选择的群体中MACS可选择多肽的至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍，如通过流式细胞术例如，在流式细胞仪MiltenyiBiotec上所检测。生成生产细胞群体的方法描述于本文中。如本文所用，“生产细胞的群体”是表达可检测水平的一种或多种多肽的细胞的群体，所述多肽例如由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽。生成生产细胞群体的方法描述于本文中。如本文所用，“多顺反子mRNA”是含有能编码两个或更多个多肽的至少两个开放阅读框ORF的mRNA。如本文所用，“无药物选择培养基”是缺乏药物例如，甲氨蝶呤MTX的培养基，所述药物用于选择表达赋予该群体或子群体抗药性的蛋白质例如，二氢叶酸还原酶的细胞的群体或子群体。如本文所用，“基于培养基的选择”是改变培养基以包括选择剂例如，MTX或排除培养基组分的选择工序，所述选择工序导致选择抵抗选择剂的或可在所排除的培养基组分不存在下存活的子群体。如本文所用，“核苷酸缺乏培养基”是缺乏或含有低水平例如，小于10微克mL核苷酸的培养基，具有核碱基腺嘌呤A、胞嘧啶C、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、次黄嘌呤或胸苷中的一种或多种的。在一些实施方案中，核苷酸缺乏培养基是缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基。示例性核苷酸缺乏培养基包括CDCHO培养基Gibco,LifeTechnologies，目录号10743液体和12490颗粒状。如本文所用，“生存力标志物”是指示细胞生存力的细胞特征并且可通过FACS来检测。示例性生存力标志物包括前向散射、侧向散射、碘化丙啶染色或其组合。如本文所用，术语“非AUG起始密码子”意欲包括任何非AUG多核苷酸通常三联体，其用作翻译起始的起始位点，并且效率相对于AUG起始密码子有所降低。天然存在的备选起始密码子使用为本领域中已知并且描述于例如以下文献中：Kozak1991J.CellBiol.1154:887-903；Mehdi等人1990Gene91:173-178；Kozak1989Mol.Cell.Biol.911:5073-5080。通常，非AUG起始密码子具有与AUG相比降低的翻译效率；例如，备选起始密码子GUG可具有与AUG100％相比3-5％的翻译效率。非AUG起始密码子的翻译效率还可受其序列上下文影响；例如，据报道最佳Kozak共有序列对在非AUG起始密码子的翻译起始具有正面效应Mehdi等人1990Gene91:173-178；Kozak1989Mol.Cell.Biol.911:5073-5080。完整KozakDNA共有序列是GCCRCCATGGSEQIDNO:1，其中起始密码子ATGRNA中为AUG为粗体，ATG起始密码子中的A指定为+1位置，并且位置-3的“R”是嘌呤A或G。两个最保守位置是嘌呤，优选地-3位置的A和+4位置的GKozak1991JCellBiol1154:887-903。针对可选择标志物的减弱表达的备选起始密码子使用描述于美国专利公开案20060172382和美国专利公开案20060141577中，其全部内容是通过引用并入本文中。本领域技术人员将认识到，本文描述为DNA的序列将具有作为RNA分子的相关序列，例如DNA序列ATG将对应于RNA序列AUG，并且反之亦然。如本文所用，术语“快速增量分选”和“快速增量”是指荧光激活细胞分选FACS分批选择表达靶多肽的生产细胞的方法。该方法包含以下步骤：a提供生产细胞的异质性群体，其中该群体中的生产细胞表达不同水平的由相同多顺反子mRNA编码的FACS可选择多肽和靶多肽；b使用FACS从生产细胞的异质性群体选择生产细胞的第一异质性子群体，其中第一异质性子群体中的生产细胞以高于a中异质性群体的至少80％生产细胞的水平的水平表达FACS可选择多肽；和c在无药物选择培养基中扩增生产细胞的第一异质性子群体，由此产生生产细胞的经扩增第一异质性子群体。快速增量方法可进一步包含以下步骤：d使用FACS从步骤c中生产细胞的经扩增第一异质性子群体选择生产细胞的第二异质性子群体，其中第二子群体中的生产细胞以高于步骤c中生产细胞的经扩增第一异质性子群体中至少80％生产细胞的水平的水平表达FACS可选择多肽；和e在无药物选择培养基中扩增生产细胞的第二异质性子群体，由此产生生产细胞的经扩增第二异质性子群体。如本文所用，术语“EPIC”是指细胞的早期转染后分离，如本文中更详细地描述。如本文所用，术语“FLARE”是指“流式细胞术减弱的报道基因表达”。FLARE是利用含有至少两个开放阅读框ORF的多顺反子mRNA的表达系统，上游ORF含有非AUG起始密码子并编码FACS可选择多肽，并且下游ORF含有AUG起始密码子并编码靶多肽。参见美国专利申请公开案第20090239235号，其是全文通过引用并入本文中。如本文所用，术语“约”应该是指所述值上下10％的公差范围。因此，在术语“约”用于修饰所述值时，所指示范围将涵盖在所述值的±0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％内的任何数字。II.生产细胞的早期选择方法在一些方面中，本公开文本涉及产生表达靶多肽的生产细胞的群体的方法。在一些实施例中，该方法包括：a用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；b在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达该可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和c扩增经转染的宿主细胞的该子群体，由此产生表达该靶多肽的生产细胞的群体。经转染的早期表达细胞可包含不同类别的外源DNA，所述外源DNA的一部分尚未整合到细胞的基因组DNA中，并且一部分已整合到细胞的基因组DNA中。这些类型的DNA具有引起其所编码的一个或多个多肽表达的潜力。用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽。生产细胞可使用适合于从多顺反子mRNA产生靶多肽的任何细胞类型来生成。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。适合于产生靶多肽的真核细胞的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢CHO细胞系，包括名为CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S、CHO-K1和仓鼠细胞系BHK-21的细胞系；名为NIH3T3、NS0、C127的鼠类细胞系；猿猴细胞系COS、Vero；以及人类细胞系HeLa、HEK293也称为293、NIH-3T3、U-937和HepG2。适宜宿主细胞的其他例子包括酵母细胞、昆虫细胞例如，施耐德果蝇DrosophilaSchneiderS2细胞、Sf9昆虫细胞WO9426087、BTI-TN-5B1-4HighFiveTM昆虫细胞Invitrogen、植物细胞、鸟类细胞和牛细胞。可用于表达的酵母的例子包括但不限于酵母菌属Saccharomyces、裂殖酵母属Schizosaccharomyces、汉逊酵母属Hansenula、假丝酵母属Candida、球拟酵母属Torulopsis、子囊菌酵母属Yarrowia和毕赤酵母属Pichia。参见例如美国专利第4,812,405号、第4,818,700号、第4,929,555号、第5,736,383号、第5,955,349号、第5,888,768号和第6,258,559号。生产细胞的其他例子可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌E.coli例如，菌株DH5αTMInvitrogen,Carlsbad,CA、PerC6Crucell,Leiden,NL、枯草杆菌B.subtilis和或其他适宜细菌。细胞可从商业供货商购得，例如美国模式培养物保藏所AmericanTypeCultureCollection，ATCC，Rockville,MD，或使用本领域已知的方法从分离物培养。为了制造生产细胞，可使用任何适宜的转移技术例如，通过转染、转化、电穿孔或转导将一个或多个重组或外源多核苷酸插入宿主细胞中。编码一个或多个mRNA的载体包括DNA载体。可用载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子和微型染色体，其中质粒是典型实施方案。通常，所述载体进一步包括信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、启动子和转录终止序列其与编码多顺反子mRNA的基因可操作连接以帮助表达。适宜DNA病毒载体的例子包括腺病毒Ad和腺伴随病毒AAV。用于递送多核苷酸的基于腺病毒的载体为本领域中已知并且可以商业方式获得，或者通过标准分子生物学方法来构建。腺病毒Ad是一组病毒，包括超过50种血清型。参见例如国际专利申请案第WO9527071号。用于本公开文本中的其他病毒载体包括源自牛痘、疱疹病毒例如，单纯疱疹病毒HSV和反转录病毒的载体。基因递送媒剂还包括若干种非病毒载体，包括DNA脂质体复合物，以及靶向病毒蛋白-DNA复合物。对于在转染中的使用，在某些实施方案中，环状载体可例如通过在一个或多个限制性内切核酸酶位点进行限制性酶切来预线性化，即在引入宿主细胞中之前线性化。线性化被认为是整合到基因组中所需的，并且这可通过预线性化或以随机方式通过在宿主细胞内天然存在的内切核酸酶来实现。预线性化具有将一定程度的控制引入限制位点中的潜在优点。因此，在某些实施方案中，可将包括超螺旋结构环状载体的环状载体引入宿主细胞中。在根据本发明的某些实施方案中，一个或多个载体在转染时为线性。既含有启动子又含有多核苷酸可以操作性连接的克隆位点的载体为本领域中已知并且可从商业供货商获得。所述载体能在体外或在体内转录RNA，并且可从诸如AgilentTechnologies和PromegaCorporation等来源购得。为了优化表达和或体外转录，可能需要移除、添加或改变5'和或3'非翻译部分以消除额外的可能不合适的备选翻译起始密码子或可在转录或翻译水平上干扰或减少表达的其他序列。或者，可紧靠起始密码子的5'插入共有核糖体结合位点以增强表达。可提供启动子用于在生产细胞中表达。启动子可为组成型或诱导型。例如，启动子可以可操作连接至编码多顺反子mRNA的核酸，使得其引导所编码多肽的表达。可获得原核和真核宿主的多种适宜启动子。原核启动子包括用于大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子；3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶和葡糖激酶。真核启动子包括诱导型酵母启动子，例如醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，例如多瘤病毒、鸡痘病毒和腺病毒例如，腺病毒2、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒CMV，特定地，立即早期基因启动子、反转录病毒、B型肝炎病毒、肌动蛋白、Rous肉瘤病毒RSV启动子和早期或晚期猿猴病毒40SV40，以及非病毒启动子，例如EF-1αMizushima和Nagata1990NucleicAcidsRes.1817:5322。本领域技术人员将能够选择适当启动子在给定宿主细胞中表达任何给定多肽。如果适合于例如在高等真核生物细胞中表达，可包括其他增强子元件来代替被发现位于上述启动子中的增强子，或与所述增强子共存。适宜哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠类IgG2a基因座参见WO2004009823。所述增强子通常位于载体上的启动子上游位点，同时其还可位于其他位置，例如在非翻译区内或在多腺苷酸化信号下游。增强子的选择和定位可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。另外，载体例如，表达载体可包含用于选择携带载体的宿主细胞的可选择标志物，以及在可复制载体的情形中的复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常用可选择标志物，并且可用于原核细胞例如，f3-内酰胺酶基因氨苄西林抗性、tet基因四环素抗性和真核细胞例如，新霉素G418或遗传霉素、gpt霉酚酸、氨苄西林或潮霉素B抗性基因。二氢叶酸还原酶DHFR基因允许在多种宿主中用甲氨蝶呤或核苷酸缺乏培养基进行选择。类似地，谷氨酰胺合成酶GS基因允许用甲硫氨酸砜亚胺进行选择。编码宿主的营养缺陷型标志物的基因产物的基因例如，LEU2、URA3、HIS3通常在酵母中用作可选择标志物。病毒例如，杆状病毒或噬菌体载体以及能整合到宿主细胞基因组中的载体例如逆转录病毒载体的使用也有所预期。在真核系统中，多聚腺苷酸化和终止信号可以可操作连接到编码如本文所述多顺反子mRNA的多核苷酸。所述信号通常位于开放阅读框的3'。在哺乳动物系统中，多聚腺苷酸化终止信号的非限制性例子包括源自以下各项的信号：生长激素、延伸因子-1α和病毒例如，SV40基因或逆转录病毒长末端重复序列。在酵母系统中，多聚腺苷酸化终止信号的非限制性例子包括源自磷酸甘油酸酯激酶PGK和醇脱氢酶1ADH基因的信号。在原核系统中，通常不需要多腺苷酸化信号，并且通常代之以采用较短并且更确定的终止子序列。多聚腺苷酸化终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的相容性。除了上文以外，可用于提高产率的其他特征包括染色体重建元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。本公开文本的生产细胞含有编码多顺反子mRNA分子的重组多核苷酸例如，重组cDNA，靶多肽和可选择多肽是从来自所述多顺反子mRNA分子的不同ORF单独翻译。在一些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽。在某些实施方案中，本公开文本的生产细胞含有多个重组多核苷酸，其各自编码多顺反子mRNA分子，靶多肽和可选择多肽是从来自所述多顺反子mRNA分子的不同ORF单独翻译。每一靶多肽可由此与特定可选择多肽相关。在一些实施方案中，可选择多肽是细胞表面多肽。细胞表面多肽的例子包括但不限于CD2、CD20、CD52和CD59。CD52和CD59细胞表面多肽的示例性非限制性氨基酸序列提供于下文中。示例性人类CD52多肽的氨基酸序列：LERFLFLLLTISLLVLVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFSSEQIDNO:2示例性人类CD59多肽剪接受体突变体的氨基酸序列：LGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNNCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHPSEQIDNO:3示例性小鼠CD52多肽的氨基酸序列：LKSFLLFLTIILLVVIQIQTGSLGQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKSGASSIIDAGACSFLFFANTLICLFYLSSEQIDNO:4在一些实施方案中，提供第一ORF，其编码可选择多肽，例如CD52或CD59。CD52和CD59的示例性非限制性ORF序列提供于下文中。示例性人类CD52ORF的核苷酸序列：ttggagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctcgttttggtacaaatacaaaccggactctccggacaaaacgacaccagccaaaccagcagcccctcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttcgtcgccaacgccataatccacctcttctgcttcagttgaSEQIDNO:5示例性人类CD59ORF的核苷酸序列：ttgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctcgctgtcttctgccattccggtcatagcctgcagtgctacaactgtcctaacccaactgctgactgcaaaacagccgtcaattgttcatctgattttgacgcgtgtctcattaccaaagctgggttacaagtgtataacaactgttggaagtttgagcattgcaatttcaacgacgtcacaacccgcttgagggaaaacgagctaacgtactactgctgcaagaaggacctgtgtaactttaacgaacagcttgaaaacggagggacatccttatcagagaaaacagttcttctgctggtgactccatttctggcagctgcttggagccttcatccctaaSEQIDNO:6示例性小鼠CD52ORF的核苷酸序列：ttgaagagcttcctcctcttcctcactatcattcttctcgtagtcattcagatacaaacaggatccttaggacaagccactacggccgcttcaggtactaacaaaaacagcacctccaccaaaaaaacccccttaaagagcggggcctcatccatcatcgacgcgggcgcttgcagtttcctcttcttcgccaatacccttatttgcctcttctacctcagctaactgagtaaSEQIDNO:7如下文所讨论，前述示例性ORF已各自经修饰以消除所有内部ATG三联体。在一些实施方案中，提供第二ORF，其编码靶多肽，例如抗体、酶或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，单独翻译是通过使用用于可选择多肽的翻译起始的非AUG起始密码子和使用用于靶多肽的翻译起始的AUG起始密码子来完成。在这个实施方案中，通常编码靶多肽的多核苷酸位于编码可选择多肽的多核苷酸的下游。单独翻译还可使用内部核糖体进入位点IRES来实现。在一些实施方案中，IRES元件位于编码靶多肽的多核苷酸的上游和编码可选择多肽的多核苷酸的下游。在一些实施方案中，IRES元件位于编码可选择多肽的多核苷酸的上游和编码靶多肽的多核苷酸的下游。在一些实施方案中，非AUG起始密码子以使可选择多肽的翻译效率低于靶多肽翻译的方式位于编码可选择多肽的DNA内。为了实现降低的翻译效率，可将可选择多肽的AUG起始密码子变为备选非AUG起始密码子，其例子包括但不限于：CUG、GUG、UUG、AUU、AUA和ACG。因此，在使用备选非AUG起始密码子时，可选择多肽的表达可相对于共表达的靶多肽的表达有所减弱。除了改变起始密码子以外，编码可选择多肽的DNA可在所有内部ATG三联体处经修饰，以防止翻译的内部起始。在一些实施方案中，可选择多肽具有短氨基酸序列建新公司GenzymeCorporation用于生物制品生产的细胞的早期转染后分离（EPIC）593804:SA9-179CPCUS62405,3922016-10-078PatentIn3.5版110DNA人工序列合成的寡核苷酸1gccrccatgg10261PRT人Homosapiens2LeuGluArgPheLeuPheLeuLeuLeuThrIleSerLeuLeuValLeu151015ValGlnIleGlnThrGlyLeuSerGlyGlnAsnAspThrSerGlnThr202530SerSerProSerAlaSerSerAsnIleSerGlyGlyIlePheLeuPhe354045PheValAlaAsnAlaIleIleHisLeuPheCysPheSer5055603128PRT人Homosapiens3LeuGlyIleGlnGlyGlySerValLeuPheGlyLeuLeuLeuValLeu151015AlaValPheCysHisSerGlyHisSerLeuGlnCysTyrAsnCysPro202530AsnProThrAlaAspCysLysThrAlaValAsnCysSerSerAspPhe354045AspAlaCysLeuIleThrLysAlaGlyLeuGlnValTyrAsnAsnCys505560TrpLysPheGluHisCysAsnPheAsnAspValThrThrArgLeuArg65707580GluAsnGluLeuThrTyrTyrCysCysLysLysAspLeuCysAsnPhe859095AsnGluGlnLeuGluAsnGlyGlyThrSerLeuSerGluLysThrVal100105110LeuLeuLeuValThrProPheLeuAlaAlaAlaTrpSerLeuHisPro115120125474PRT小鼠Musmusculus4LeuLysSerPheLeuLeuPheLeuThrIleIleLeuLeuValValIle151015GlnIleGlnThrGlySerLeuGlyGlnAlaThrThrAlaAlaSerGly202530ThrAsnLysAsnSerThrSerThrLysLysThrProLeuLysSerGly354045AlaSerSerIleIleAspAlaGlyAlaCysSerPheLeuPhePheAla505560AsnThrLeuIleCysLeuPheTyrLeuSer6570574PRT人Homosapiens5LeuLysSerPheLeuLeuPheLeuThrIleIleLeuLeuValValIle151015GlnIleGlnThrGlySerLeuGlyGlnAlaThrThrAlaAlaSerGly202530ThrAsnLysAsnSerThrSerThrLysLysThrProLeuLysSerGly354045AlaSerSerIleIleAspAlaGlyAlaCysSerPheLeuPhePheAla505560AsnThrLeuIleCysLeuPheTyrLeuSer65706387DNA人Homosapiens6ttgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctcgctgtcttctgc60cattccggtcatagcctgcagtgctacaactgtcctaacccaactgctgactgcaaaaca120gccgtcaattgttcatctgattttgacgcgtgtctcattaccaaagctgggttacaagtg180tataacaactgttggaagtttgagcattgcaatttcaacgacgtcacaacccgcttgagg240gaaaacgagctaacgtactactgctgcaagaaggacctgtgtaactttaacgaacagctt300gaaaacggagggacatccttatcagagaaaacagttcttctgctggtgactccatttctg360gcagctgcttggagccttcatccctaa3877233DNA小鼠Musmusculus7ttgaagagcttcctcctcttcctcactatcattcttctcgtagtcattcagatacaaaca60ggatccttaggacaagccactacggccgcttcaggtactaacaaaaacagcacctccacc120aaaaaaacccccttaaagagcggggcctcatccatcatcgacgcgggcgcttgcagtttc180ctcttcttcgccaatacccttatttgcctcttctacctcagctaactgagtaa23388123DNA人工序列合成的多核苷酸8ggatccgctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcagg60cagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccagg120ctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtccc180gcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgcccca240tggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctatt300ccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgggggggg360ggacagctcagggctgcgatttcgcgccaaacttgacggcaatcctagcgtgaaggctgg420taggattttatccccgctgccatcatggttcgaccattgaactgcatcgtcgccgtgtcc480caaaatatggggattggcaagaacggagacctaccctggcctccgctcaggaacgagttc540aagtacttccaaagaatgaccacaacctcttcagtggaaggtaaacagaatctggtgatt600atgggtaggaaaacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaaggacagaatt660aatatagttctcagtagagaactcaaagaaccaccacgaggagctcattttcttgccaaa720agtttggatgatgccttaagacttattgaacaaccggaattggcaagtaaagtagacatg780gtttggatagtcggaggcagttctgtttaccaggaagccatgaatcaaccaggccacctc840agactctttgtgacaaggatcatgcaggaatttgaaagtgacacgtttttcccagaaatt900gatttggggaaatataaacttctcccagaatacccaggcgtcctctctgaggtccaggag960gaaaaaggcatcaagtataagtttgaagtctacgagaagaaagactaacaggaagatgct1020ttcaagttctctgctcccctcctaaagctatgcatttttataagaccatgggacttttgc1080tggctttagatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaacta1140cctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaa1200ctactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggag1260cagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagt1320gatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggta1380gaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagt1440aatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatac1500aagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcat1560aacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgct1620caaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatg1680tatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgc1740tttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgt1800tgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaattt1860cacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgt1920atcttatcatgtctggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccac1980aggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgcca2040cttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccgtggccgggggac2100tgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctca2160acctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgc2220ccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcg2280ccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctct2340gggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttg2400cggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaac2460gtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtct2520tgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccg2580gcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatc2640agggacagcttcaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgt2700ttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggt2760ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtt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权利要求：1.一种产生表达靶多肽的生产细胞的群体的方法，该方法包括：a用编码一个或多个mRNA的一个或多个载体转染宿主细胞，其中该一个或多个mRNA编码可选择多肽和靶多肽；b在转染2至15天内从经转染的宿主细胞分离表达该可选择多肽的经转染的早期表达宿主细胞的子群体；和c扩增经转染的宿主细胞的该子群体，由此产生表达该靶多肽的生产细胞的群体。2.权利要求1的方法，其中步骤b和c各自在无药物选择培养基中进行。3.权利要求1或2的方法，其进一步包含从生产细胞的该群体分离该靶多肽。4.权利要求1或2的方法，其进一步包括从该经扩增的子群体分离一个或多个经转染的单宿主细胞，并培养该一个或多个经转染的单宿主细胞以产生该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体。5.权利要求4的方法，其中与在步骤c获得的经转染但未克隆的宿主细胞的稳定池相比，该一个或多个经转染的单宿主细胞的克隆群体中的至少一个产生该靶多肽产量的2倍到30倍提高。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中经历b中的选择的经转染的宿主细胞含有至少80x106至120x106个细胞。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中步骤b中的分离是在转染后不到6天进行。8.权利要求7的方法，其中步骤b中的分离是在转染后2天与4天之间进行。9.权利要求7的方法，其中步骤b中的分离是在转染后2天进行。10.权利要求7的方法，其中步骤b中的分离是在转染后3天进行。11.权利要求1至10中任一项的方法，其中在步骤c中的扩增之前，经转染的宿主细胞的该子群体含有0.5x106至6.0x106个细胞。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中步骤c中的扩增进行4至31天。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中该一个或多个载体中的第一载体对编码该靶多肽的mRNA进行编码，并且该一个或多个载体中的第二载体对编码该可选择多肽的mRNA进行编码。14.权利要求1至13中任一项的方法，其中编码该靶多肽的mRNA和编码该可选择多肽的mRNA二者编码于一个载体上。15.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b中的分离采用磁激活细胞分选MACS、荧光激活细胞分选FACS或ClonePix。16.前述权利要求中任一项的方法，其中该可选择多肽是FACS可选择多肽并且步骤b中的分离采用FACS。17.前述权利要求中任一项的方法，其中该靶多肽和该可选择多肽形成融合多肽。18.权利要求1至16中任一项的方法，其中该靶多肽和该可选择多肽是由单一多顺反子mRNA编码。19.权利要求18的方法，其中该多顺反子mRNA包含编码该可选择多肽的第一开放阅读框ORF和编码该靶多肽的第二ORF，其中该第一ORF位于该第二ORF的5'。20.权利要求19的方法，其中该第一ORF具有非AUG起始密码子。21.权利要求20的方法，其中该非AUG起始密码子是Kozak共有序列中的UUG、GUG或CUG。22.权利要求19至21中任一项的方法，其中该第二ORF具有AUG起始密码子。23.权利要求19至22中任一项的方法，其中编码该可选择多肽的ORF缺乏任何AUG序列。24.权利要求1至23中任一项的方法，其中该可选择多肽是CD52或CD59。25.权利要求1至24中任一项的方法，其中该靶多肽是治疗剂。26.权利要求1至25中任一项的方法，其中该靶多肽是分泌蛋白。27.权利要求1至26中任一项的方法，其中该靶多肽是抗体或Fc融合蛋白。28.权利要求1至27中任一项的方法，其中该宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。29.一种经转染的宿主细胞的克隆群体，所述经转染的宿主细胞表达可通过前述权利要求中任一项的方法获得的可选择多肽和靶多肽。30.权利要求29的克隆群体，其中与b中经转染的宿主细胞的子群体相比，该克隆群体产生该靶多肽产量的2倍至30倍提高。

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