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申请/专利权人：信雅生物科技（苏州）有限公司

摘要：本发明提供了一种新型人转录因子——锌指BED型包涵子1在临床肺癌中表达情况及该基因在肺癌中的作用，涉及分子生物学领域及肿瘤学领域。锌指BED型包涵子1zinc finger,BED‑type containing 1的国际命名为ZBED1，基因ID号为9198。基于该基因序列所研制的siRNA可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。利用小干扰RNA阻断肺癌细胞中ZBED1蛋白表达，可以抑制肺癌细胞的增殖、克隆形成能力及细胞周期进展。本发明公开了能特异性阻断ZBED1基因的小干扰RNA的制备方法，以及该小干扰RNA对肺癌细胞的作用。

主权项：1.一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法，其特征在于：针对人ZBED1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBED1基因的靶序列：RNAi‑1‑F：GGAAGUACAUCUCUACCAA；RNAi‑1‑R：CCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdT；RNAi‑2‑F：GCAAACUGGUGGAGUACUU；RNAi‑2‑R：CGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT。

全文数据：一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法及其应用技术领域本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体的涉及到一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法及其应用。背景技术锌指BED型包涵子1zincfinger,BED-typecontaining1，ZBED1又名DNA复制相关元素结合因子，属于锌指蛋白ZBED家族，由694个氨基酸残基组成，分子量约78kDa，其编码蛋白被认为是一种调控DNA复制、染色质结构重塑、蛋白质合成、细胞周期等的关键转录因子。令人感兴趣的是，ZBED1在肿瘤中的研究至今未见报道。前期工作发现采用免疫组化检测ZBED1在人肺癌组织高表达，并且与肿瘤T分期显著相关。由此提示，ZBED1是人肺癌特异高表达基因，可能在肺癌生长中发挥重要作用。发明内容本发明的目的在于针对ZBED1基因的研究现状，阐明其在肺癌中的表达情况，提出能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法及其应用。本发明的目的通过以下技术方案实现。1.检测ZBED1蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：1临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例Ⅰ—ⅢA期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例；患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；2苏木素—伊红HE染色进行病理诊断；3免疫组化检测ZBED1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；4统计分析ZBED1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；2.一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法，包括以下步骤：1利用NCBIhttps:www.ncbi.nlm.nih.govgene数据库，获得人ZBED1基因的转录本及编码CDS区信息转录本1：NM_001171136，CDS区：1283-2367，具体序列见序列表；2根据siRNA序列设计原则，针对人ZBED1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZEBD1基因的靶序列；5’——3’RNAi-1-FGGAAGUACAUCUCUACCAARNAi-1-RCCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdTRNAi-2-FGCAAACUGGUGGAGUACUURNAi-2-RCGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT3化学合成该靶序列；3.验证2中siRNA抑制效率的方法，其特征在于直接利用Westernblot检测ZBED1蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH；4.检测ZBED1基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：1细胞增殖活性检测MTS法：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul完全培养基，置于5％CO237℃培养箱中培养1天后，每孔加MTS溶液5mgml30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测5天；2流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2M柠檬酸柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×PBS洗2次，0.1％TritonPBS配制洗1次，再用500μgmlPI和0.1％RNAaseA，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。本发明的有益效果：1.本发明公开了ZBED1蛋白在临床肺癌组织中高表达。2.用本发明研制的siRNA能特异性抑制肺癌细胞系中内源性ZBED1的表达。3.MTS法检测细胞增殖表明，与转染对照RNA相比，转染本发明研制的两个siRNA能抑制肺癌细胞的增殖能力，说明ZBED1基因能促进肺癌细胞的增殖。4.流式细胞术检测肺癌细胞周期表明，与转染对照RNA相比，转染本发明研制的两个siRNA能抑制肺癌细胞的细胞周期进程，使其阻滞于G1期，说明ZBED1基因能促进肺癌细胞周期从G1期向S期转化。5.功能学结果提示，本发明研制的siRNA可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。附图说明图1为ZBED1蛋白在临床肺癌组织中高表达；图2为两种siRNA能特异性抑制肺癌细胞系中内源性ZBED1的表达；图3为两种siRNA对肺癌细胞增殖能力的抑制情况；图4为两种siRNA对肺癌细胞细胞周期的阻滞情况；图5为2个能特异性敲减人ZBED1基因的靶序列。如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。具体实施方式1.检测ZBED1蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：1临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例Ⅰ—ⅢA期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例；患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；2苏木素—伊红HE染色进行病理诊断；3免疫组化检测ZBED1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；4统计分析ZBED1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；如图1所示，为ZBED1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况，从图1可以看出，ZBED1在70.50％肺癌组织中表达，在46.70％癌旁组织中表达，说明ZBED1蛋白在肺癌组织中的表达较癌旁高。2.研制能特异性抑制ZBED1基因的siRNA，包括以下步骤：1利用NCBIhttps:www.ncbi.nlm.nih.govgene数据库，获得人ZBED1基因的转录本转录本1：NM_001171136.1及编码CDS区信息具体序列见序列表；转录本1variant1,mRNA：CGCGGGCGGCGCGGAAGCGGCGGCGGCGCGGCCGGGGCAGCCATGTCGCCATTGTCTGCGGCGCGGGCGGCCCTGCGGGTCTACGCGGTAGGCGCCGCGGTGATCCTGGCGCAGCTGCTGCGGCGCTGCCGCGGGGGCTTCCTGGAGCCAGCAGGTCCCCACGCATGAGCAGCCGTCCAGCAGGCAGGCTCCGGTGGAGAAGCAATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAGCGAGGAAGCGTGTTGTCTTACAAGTCATCCCCGCAGCAGCCCATTGGATGCTTTGCTGTAAATACTTACCCGGTCAGCTTGGTTTTGAACCTCAGAGACCATCCACTGTCTTTGACACCTAGAAGGTGGAAAAAGGAAAGAGATTTGAGAAGTGAGAGAGGGTCGGGGGCGGTGGCTCCTGTCTATAATCGCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCAGCTGAGGTCAGGAGATCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGACTGATGGCATGTGCCTGTAATCCCAGCTTCTGGAGGCTGAGGCCAGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTAAGCTGAGATCGCTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCGAGACTCTCTCAAAAAGAAAAAAGAAGACACAAGAGAGGTGGCTTTGAGTGGGTTTCCTTTCCTCCCCTATTCCCGGGGCCCGGACGACTTCTGCTTGGGAACTGCCAACGCTTCTGCTTGGGAATTGCGTGCAGCAGAGCCTAGAGGAGCTGTTCCTTCCTTCACAGATACTTAAGACCTCCACCATGTCTGATTCGAGTTCTCCCTGGGAGGGTTTAGAAGAAACGCAGGAACATTCTGGGTGGCGTCGAAGGAGCCTTTCCCGATCATCATGTGTGACTTCTGCGAGGTCCAGATCACTGAATTCATGTTTACATTCTCGTGCAAGCAGGGACCTCTTGCTTCTGAGAAATGGGGAAGAGACCTTTTAGCCAAAATGCCCTTCTTAAAAAGAGAGACCTTTTTTTTTAATGTTCGGTTAAAAATGTGACAGATGAGTACAAAAATGCAGACACTTAACAAAAAGCAAACAGAAAAAAAAGTGTGGAATGTGTTGTATTTTCGACAGGTTGCTGCCAGAGAGCCTGCTTCCTGCTGCCTGCCGAAATTTCACTTTGCGGAGTTGGTCCTTAAAACTGGGCGGTGGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACCAACATGGTGAAACCTCGTGTCTACTAAAAATACAAGAAACTAGCCAGATGCGGTGGCACCCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCGGAAGATTCGCTTGAGCCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGACTACGCCACTGCACTCCAGCCTGGAGGCCAGAGTGAGACTCCGTCTCAAAACAAAACAAAAGTGGGTGGCTCACGGGTCCGGAGGTTATGTCTTCGGTGTCTCAGCCCTAAAAGTCCAGTTCCCCCGTGCGGCCAGCTTTTCCACATAAGGTGTTTTTGATTTGATTACCGGAAAGGACTCTTGATTCTTCTCTTTTAAACTGAATACCATAGGGGAAATGAATTTTAAAATATTGCCCCCGGAGGGGTTTTCCGTGGCTGGATTCCTGCGAGTTGCTTTCAGTCATTCAGGGAAACAGAAAGACGTTTTCCAACATGTAGAACTGCTTTTTAACTGGAGGAAAAATACTTCAGGAGGCTTAGCATATTGCTTGGATTCTACGTGCAGCGGGTTCTCTGCCTCCGTGAAGACAAGCTGGGCTGGGGAGAACGGTGTCTAGGAGGGATGACCCCACTCAGCTCCAGGCAGTGTTCTGCCGAGACCCCAAGAACTCGGGGTGTCAGAGGGCAAAGGAACTACCTGCCTTTCACGGCTGCTGACTTCTCAGGGCTGCAAGCAGCACAGAATGTTATCCTTACGTCCTGAGCCGGTTTAAGTCTGTGGAAAAGGAAGCACGGGAGAAATCCACGTAACCTTTGCTTTCTTTTTAAGGGAAGCGGTTCCGCCGTGAACTTGGAACCCTCAGCTCCGGGTGTTCTCGGCAGAAGGGCAGCTGGAAGGGACACAGTGGGGCAGGCTTTGGGGTTGCTCCCTGTTCTGCCCCGAGGCCGGGGACGCAGGGCAGCCCACGCCTCCGTGGGCTCCATTCTGTAGCATTGCCAGCGTTCTCTTCACGTCTCTAACAATCCTTCGCTTTTCCTCACTCACGTGGAAATGTGAACTGTCCCGGCTCTGTCTTCATTTTTATTTTTAAGCCATCGTTCCCCTCCTGAACGGTTGCCCCTTATTTAATGCTGTAAAGTTGGACTGTTGTTCAATAAACCAGAGCAATGCATTAGCTCCTCATTCATTTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAACDS区XY染色体：2488635-2490719：ATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAGATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAG2根据siRNA序列设计原则，针对人ZBED1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBED1基因的靶序列；5’——3’RNAi-1-FGGAAGUACAUCUCUACCAARNAi-1-RCCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdTRNAi-2-FGCAAACUGGUGGAGUACUURNAi-2-RCGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT3化学合成该靶序列；3.验证2中siRNA抑制效率的方法，其特征在于直接利用Westernblot检测ZBED1蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH；如图2所示，为Westernblot验证siRNA对A549肺癌细胞中ZEBD1的抑制情况，从图2可以看出，与阴性对照组siRNA比较，本发明设计的2个siRNA能使A549肺癌细胞中ZBED1蛋白表达降低，说明本发明设计的2个靶序列能明显抑制人ZBED1基因的表达，可用于后续研究。4.检测ZBED1基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：1细胞增殖活性检测MTS法：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5％CO237℃培养箱中培养1天后，每孔加MTS溶液5mgml30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测4天；如图3所示，为用siRNA干扰人ZBED1基因后肺癌细胞增殖能力的变化。从图3可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰ZBED1基因后，A549肺癌细胞增殖能力明显减慢，说明本发明设计的两个siRNA，抑制ZBED1基因后，均能抑制肺癌细胞的增殖能力。2流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2M柠檬酸柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×PBS洗2次，0.1％TritonPBS配制洗1次，再用500μgmlPI和0.1％RNAaseA，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。如图4所示，为干扰人ZBED1基因后肺癌细胞周期的变化。从图4可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰ZBED1基因后，A549肺癌细胞处于G1期细胞比例增加，说明本发明设计的两个siRNA，抑制ZEBD1基因后，均能使肺癌细胞的细胞周期阻滞于G1期。由此可见，能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA在抑制肺癌细胞增殖和制备治疗肿瘤药物方面具有良好的应用。以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法，其特征在于：针对人ZBED1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBED1基因的靶序列：RNAi-1-F：GGAAGUACAUCUCUACCAA；RNAi-1-R：CCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdT；RNAi-2-F：GCAAACUGGUGGAGUACUU；RNAi-2-R：CGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT。2.根据权利要求1的方法制备的抑制ZBED1基因表达的siRNA。3.根据权利要求2所述的抑制ZBED1基因表达的siRNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。4.如权利要求2所述的抑制ZBED1基因表达的siRNA在抑制肺癌细胞增殖中的应用。5.如权利要求2所述的抑制ZBED1基因表达的siRNA在制备治疗肿瘤药物中的应用。

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