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申请/专利权人：北京科技大学;北京首佳利华科技有限公司

摘要：本发明公开了一种利用组成型启动子Ubiquitin和雄花发育基因ZmMs1构建体创制玉米矮杆自交系的技术体系并应用于玉米农业生产的方法。该构建体包含两种基因表达盒：导致玉米获得矮杆表型的基因表达盒和除草剂抗性表达盒。将所述构建体导入玉米愈伤组织，可获得玉米转基因矮杆株系，具体表现为节数不变，节距缩短。利用回交转育和分子标记辅助选择的技术方法，可快速实现广泛优良遗传背景下矮杆自交系的创制，在玉米育种和农业生产中具有重要的应用价值。

主权项：1.一种创制玉米矮杆表型的构建体，其特征在于，包含两种类型基因表达盒：（a）第一种表达盒，为导致玉米获得矮杆表型的基因表达盒；（b）第二种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒。

全文数据：利用Ubi-ZmMs1创制矮杆玉米自交系的方法与应用技术领域一般地，本发明属于分子设计育种和植物基因工程领域。具体涉及一种玉米育性相关转录因子ZmMs1通过组成型表达可创制矮杆玉米自交系，在提高单产方面具有重要的应用价值。背景技术玉米是重要的粮饲兼用经济作物和能源作物，也是我国种植面积最大的农作物。进一步提高玉米单产仍是当前玉米育种的主要目标，而提高玉米的种植密度是提高玉米产量的重要技术手段。但密植是一把“双刃剑”，在带来高产的同时，也增加了倒伏的风险。矮杆玉米具有抗倒伏、改善株型结构、提高群体光能利用率等优点，在提高玉米种植密度获得高单产方面具有重要的应用价值。20世纪初，科学家就发现了可以控制作物株高的矮化基因。1935年，Emerson发现了玉米br2基因，它是玉米矮化的主效基因，也是目前应用最广泛的基因。br2基因会使玉米节间显著缩短，尤其是果穗下部节间位点越低，缩短越显著。矮化基因的应用，大大提高了作物的产量。20世纪60年代，我国开始玉米矮化育种的研究，研究人员从品种间杂交种“东风一号”的自交后代中发现了矮生植株，随后选育出了“南矮1号”、“龙696”、“寨金75”等矮生系。玉米的株高由茎长度和节间数决定，在玉米的一定生长期内，缩短节间长度可以有效的降低玉米的高度。按株高的遗传特点可以分为多基因体系和单基因体系。多基因矮杆体系是由多个微效基因的累积效用组成，属于数量性状遗传，易受外界环境条件的影响。目前世界上已经培育出多个多基因矮生体系玉米自交系及杂交种，如齐31，M14，武202，矮广7，种质5003及其姊妹系5005。单基因矮杆体系是由一个主效矮生基因引起玉米植株降低的体系，不受外界环境的影响，能够稳定遗传。现在已经报道的与玉米株高相关的基因大多为隐性，只有少数几个为显性基因。通过分子设计育种可以大大提高育种效率。ZmMs1是玉米花粉发育过程中参与小孢子细胞壁发育过程的转录因子，对小孢子细胞壁起负调控作用，该基因的突变能够导致小孢子凋亡和雄花败育。本发明提供了一种利用ZmMs1基因的组成型表达实现广泛的具有优良遗传背景玉米自交系的矮杆材料的创制方案，在提高玉米单产方面具有重要的应用价值。发明内容本发明要解决的问题是提供一种基于组成型启动子调控育性相关基因ZmMs1的载体（构建体）创制玉米矮杆自交系的技术方案。具体为，通过一种玉米育性相关转录因子ZmMs1在野生型玉米自交系中组成型表达，获得矮杆玉米材料。通过本发明专利提供的方法，可实现广泛的具有优良遗传背景的玉米矮杆自交系的创制，在提高玉米单产方面具有重要的应用价值。本发明所述的载体是含有两种不同类型表达盒的元件，这些功能元件的组装和表达，使转化植株表现为矮杆表型。本发明所述的两种不同类型表达盒元件，包含组成型启动子下玉米育性相关基因的表达盒和除草剂抗性基因表达盒。（1）具体地，玉米育性基因的表达盒中，从上游至下游依次包括组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。进一步地，上述育性基因即玉米ZmMs1基因，上述启动子是组成型启动子Ubiquitin；（2）除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。其中，35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区（Francketal.,Cell198021:285-294）。本发明提供的获得矮杆玉米自交系是将上述载体导入目的植物—可转化的玉米自交系中获得的。上述导入目的植物的方法是通过农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。附图说明图1为创制矮杆自交系的载体pUbi-ZmMs1质粒图谱；图2为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株株高对比图；图3为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株在S1-S5几个发育时期株高对比的统计学结果；图4为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株在S1-S5几个发育时期节数对比的统计学结果；图5为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株在S1-S5几个发育时期穗位高对比的统计学结果；图6为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株株型和主杆对比图；图7为野生型植株与pUbi-ZmMs1转基因植株的根和所有节的对比图。具体实施方式下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：pUbi-ZmMs1载体的构建含有ZmMs1表达盒Ubi:ZmMs1,SEQIDNO.1）以玉米自交系B73为材料，用PlantGenDNAKit植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板扩增ZmMs1基因，得到约650bp的PCR产物片段。所用引物如下：Oligo01：5’-ATGACCGGCGGCGGCCOligo02：5’-TCACCTGCAGGCGCTGCTC将扩增产物胶回收后连入pEASY-T5载体中，获得的载体命名为pTZmMs1。通过将pCXUN载体（PlantPhysiol.2009Jul;1503:1111–1121）的潮霉素抗性基因Hpt替换为除草剂抗性基因Bar，构建获得的载体命名为pBCXUN。以pTZmMs1质粒为模板，Oligo03和Oligo04引物进行扩增Ms1片段。所用引物如下：Oligo03：5’-GGGATGACCGGCGGCGGCCOligo04：5’-ATTGGATCCTCACCTGCAGGCGCTGCT。GGATCC为BamHI酶切位点将得到的Ms1片段用BamHI酶切和胶回收。将质粒pBCXUN用SmaI和BamHI酶切，然后进行胶回收。将以上两个片段进行连接，得到重组载体pUbi-ZmMs1。实施例2：通过农杆菌介导的玉米遗传转化获得pUbi-ZmMs1转基因株系参照AN（MethodsinEnzymology1987153:292-305）方法，将本发明所构建的载体pUbi-ZmMs1转化到农杆菌EHA105（Hoodetal.,TransgenicRes19932:208-218）中，经鉴定，选取转化获得的阳性菌株进行农杆菌介导的玉米遗传转化，并将所用菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏菌株的分类命名为“大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）”，发明人将其命名为“pUbiMs1”；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年12月20日；保藏编号：CGMCCNO.17016。通过农杆菌介导的玉米遗传转化（Frameetal.,PlantPhysiology2002129:13-22）获得不同转基因事件，具体方法如下：取1~2μg质粒，加到100μL于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷冻1分钟，移入37℃水浴中5min；迅速冰浴2min后将加入1000μLYEB液体培养基，于28℃，转速为200rpm条件下培养2~4hr，涂于含50mgL的利福平（Rifampicin）和100mgL的卡那霉素（Kanamycin）的固体YEB平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。进而通过酶切或PCR法验证获得的质粒真伪。按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米HiⅡ的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，以将本实施例构建的显性核不育载体p5126-ZmMs1M中的T-DNA（包含3个表达盒）转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离幼胚，用农杆菌悬浮液侵染幼胚，其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚的细胞（步骤1：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液（OD660=0.4~0.6，侵染培养基（MS盐4.3gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖68.5gL、葡萄糖36gL、乙酰丁香酮（AS）40mgL、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mgL，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2：共培养步骤）。幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖20gL、葡萄糖10gL、乙酰丁香酮（AS）100mgL、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mgL、琼脂8gL，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（MS盐4.3gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖30gL、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mgL、琼脂8gL，pH5.8）中至少存在一种已知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素）（步骤3：恢复步骤）。幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS盐4.3gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖5gL、甘露糖12.5gL、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mgL、琼脂8gL，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长（步骤4：选择步骤）。然后，愈伤组织在固体培养基（MS分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物再生成植物（步骤5：再生步骤）。筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4.3gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖30gL、6-苄基腺嘌呤2mgL、甘露糖5gL、琼脂8gL，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15gL、MS维生素、干酪素300mgL、蔗糖30gL、吲哚-3-乙酸1mgL、琼脂8gL，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。实施例3：pUbi-ZmMs1阳性转基因株系与B73自交系回交，调查株高性状获得的T0代植株结实后，种子种于海南三亚崖城。在苗期利用PCR方法进行pUbi-ZmMs1阳性转基因植株的鉴定，所用引物为BAR基因特异引物：OGF41Bar：5’-CTCGAGTCTACCATGAGCCCAGAAC；OGF42Bar：5’-CTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCA；PCR反应体系为：PCR反应条件为：经PCR检测为阳性的植株，与B73自交系杂交，并选取携带有pUbi-ZmMs1转基因元件的F1代杂合体植株与B73自交系进行连续回交。与野生型B73自交系相比，pUbi-ZmMs1转基因植株表现出显著的矮杆表型的特征（图2）。因此，在F1BC3代，于S1-S5几个生长发育时期调查了132株野生型B73自交系和pUbi-ZmMs1转基因材料的株高、节数和穗位高三个农艺性状，统计分析结果分别如图3、4和5所示。和野生型B73相比，转基因株系的节数没有差异（图4），而株高和穗位高显著降低（图3、图5）。图6和图7分别为2018年种于北京海淀清河基地的野生型B73与F1BC4代植株在株型、主茎、节数和节长的对比，可见，转基因株系为显著的矮杆表型，其特征为节数不变，节长变短。矮杆自交系的应用利用所述pUbi-ZmMs1阳性转基因材料，通过回交转育的方法，可培育不同遗传背景下的优良矮杆自交系，具体方法为：以pUbi-ZmMs1阳性转基因材料（pUbi-ZmMs1pUbi-ZmMs1）为母本，以不同遗传背景自交系材料（--）为父本进行杂交，杂交F1（pUbi-ZmMs1-）代与父本材料进行回交，辅以分子标记辅助选择，重复回交4-5次后，可获得既带有pUbi-ZmMs1基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料，再进行自交一次，即可获得新的遗传背景下的纯合pUbi-ZmMs1pUbi-ZmMs1转基因矮杆自交系。与高杆玉米相比，矮杆玉米抗倒伏，具有更强的耐肥性，可以密植，上疏下密利于通风透光，有利于产量的提高。同时矮杆玉米株型紧凑，为机械化种质和收割提供了有利条件。本发明公布的矮杆玉米创制方案对玉米育种和农业生产具有重要的应用价值。相关文献1、王文秀，王磊，玉米矮杆基因研究进展，生物技术通报，2018,34（11）：22-26；2、万向元、吴锁伟、周岩、谢科、李金萍、安学丽，植物花粉发育调控基因Ms1及其编码蛋白，2017.6.16，中国发明专利，专利号：ZL201410381072.5；3、万向元、吴锁伟、安学丽、谢科、李金萍、刘欣洁、柳双双、张春霞、董振营、田有辉，玉米隐性核雄性不育突变基因ms1的功能标记及其应用，中国发明专利，申请号：201810868535.9。序列表北京科技大学北京首佳利华科技有限公司利用Ubi-ZmMs1创制矮杆玉米自交系的方法与应用2SIPOSequenceListing1.0111425DNA人工序列ArtificialSequence1gatccgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcct60gttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaata120attaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaa180ttatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcg240cgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcg300tgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgc360caggggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgtt420atccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtg480cctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgg540gaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc600gtattggctagagcagcttgccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaa660tatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaat720atcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagt780agaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttca840agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga900aaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataacatggtgga960gcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggc1020tattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagc1080tatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatca1140ttgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatgg1200acccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagca1260agtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttc1320gcaagaccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcac1380cagtctctctctacaaatctatctctctcgagtctaccatgagcccagaacgacgcccgg1440ccgacatccgccgtgccaccgaggcggacatgccggcggtctgcaccatcgtcaaccact1500acatcgagacaagcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacgg1560acgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgagg1620tcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcacgcaacgcctacgactggacggccg1680agtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctaca1740cccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggc1800tgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgc1860tgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagctggact1920tcagcctgccggtaccgccccgtccggtcctgcccgtcaccgagatttgactcgagtttc1980tccataataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcctatagggtttcgc2040tcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctat2100caataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaatt2160aattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagc2220gtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccgg2280cagctcggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtccgggacggcgtcagc2340gggagagccgttgtaaggcggcagactttgctcatgttaccgatgctattcggaagaacg2400gcaactaagctgccgggtttgaaacacggatgatctcgcggagggtagcatgttgattgt2460aacgatgacagagcgttgctgcctgtgatcaccgcggtttcaaaatcggctccgtcgata2520ctatgttatacgccaactttgaaaacaactttgaaaaagctgttttctggtatttaaggt2580tttagaatgcaaggaacagtgaattggagttcgtcttgttataattagcttcttggggta2640tctttaaatactgtagaaaagaggaaggaaataataaatggctaaaatgagaatatcacc2700ggaattgaaaaaactgatcgaaaaataccgctgcgtaaaagatacggaaggaatgtctcc2760tgctaaggtatataagctggtgggagaaaatgaaaacctatatttaaaaatgacggacag2820ccggtataaagggaccacctatgatgttgaacgggaaaaggacatgatgctatggctgga2880aggaaagctgcctgttccaaaggtcctgcactttgaacggcatgatggctggagcaatct2940gctcatgagtgaggccgatggcgtcctttgctcggaagagtatgaagatgaacaaagccc3000tgaaaagattatcgagctgtatgcggagtgcatcaggctctttcactccatcgacatatc3060ggattgtccctatacgaatagcttagacagccgcttagccgaattggattacttactgaa3120taacgatctggccgatgtggattgcgaaaactgggaagaagacactccatttaaagatcc3180gcgcgagctgtatgattttttaaagacggaaaagcccgaagaggaacttgtcttttccca3240cggcgacctgggagacagcaacatctttgtgaaagatggcaaagtaagtggctttattga3300tcttgggagaagcggcagggcggacaagtggtatgacattgccttctgcgtccggtcgat3360cagggaggatatcggggaagaacagtatgtcgagctattttttgacttactggggatcaa3420gcctgattgggagaaaataaaatattatattttactggatgaattgttttagtacctaga3480atgcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtaga3540aaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaac3600aaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttt3660tccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagcc3720gtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaat3780cctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaag3840acgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc3900cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaag3960cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaac4020aggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgg4080gtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcct4140atggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgc4200tcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttga4260gtgagct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权利要求：1.一种创制玉米矮杆表型的构建体，其特征在于，包含两种类型基因表达盒：（a）第一种表达盒，为导致玉米获得矮杆表型的基因表达盒；（b）第二种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒。2.根据权利要求1所述的导致玉米表现为矮杆的基因表达盒，其特征在于：该表达盒由组成型启动子Ubiquitin、雄花发育基因ZmMs1基因和胭脂碱合成酶基因Nos终止子可操作地相连（SEQIDNO.1）；根据权利要求1所述的除草剂抗性基因的表达盒，其特征在于：除草剂抗性基因的表达盒由花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子、除草剂抗性基因（包括但不限于BAR基因）和花椰菜花叶病毒的35SpolyA终止子可操作地相连（包括但不限于SEQIDNO.2）。3.一种包含权利要求1所述构建体的重组载体和植物细胞，所述植物为玉米。4.一种用于创制包含权利要求1所述构建体的玉米矮杆自交系的方法，所述方法包括：（a）提供第一植株，该植株是一种可用于遗传转化的玉米自交系材料，包括但不限于B104、综31、HiII；（b）创制第二植株，所述第二植株是，首先向上述第一植株中引入权利要求1所述构建体，且所述构建体T-DNA只存在于玉米同源染色体的其中一条染色体上，即所述构建体T-DNA为半合子状态，该植株表现为不依赖于其背景基因型的矮杆表型；进一步通过自交，可获得纯合构建体T-DNA状态，即两条染色体上都含有构建体T-DNA，此植株即为所述第二植株。5.一种创制不同遗传背景下优良矮杆玉米自交系的方法，所述方法具体为：（a）权利要求4所述第二植株与其它玉米常规自交系进行人工杂交，获得F1杂交种；（b）该F1杂交种为矮杆株系，含有转基因元件，与权利要求5（a）中所述常规玉米自交系进行回交，获得F1BC1代；（c）通过对F1BC1代植株的基因型及表型鉴定，选择含有转基因元件的矮杆株系进一步与自交系进行回交，连续3-4代后进行自交，获得该玉米自交系的纯合矮杆株系。6.创制的不同遗传背景下优良矮杆玉米自交系在生产中的应用。

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