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申请/专利权人：中国人民解放军后勤工程学院;宁波大学;宁波博奥生物工程有限公司

摘要：本发明提供一种检测喷气燃料污染真菌Khuskia oryzae的LAMP‑LFD检测方法，设计了三对LAMP引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3，其中FIP为5’端生物素标记引物，LF为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系进行扩增，然后用LFD试纸条检测。本发明LAMP‑LFD方法检测Khuskia oryzae相对于传统PCR方法，不仅做到了结果可视化，还具有特异性强、操作简单、耗时短、灵敏度高以及不依赖昂贵的特殊仪器的特点。运用本发明的方法对储备中的喷气燃料进行检测，能更好地提高了特征真菌污染喷气燃料的预警能力，这对保障喷气燃料质量及飞机的飞行安全有着重要的意义。

主权项：1.一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：F3，序列为GGTTCTGGCATCGATGAAGA、B3，序列为AGAGGACTACTGCCACTCC、FIP，序列为TGGGCGCAATGTGCGTTCAAACGCAGCGAAATGCGATA、BIP，序列为CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATACGGAGGCCGTAGAGTC、LF，序列为GATTCGATGATTCACTGAATTCTGC、LB，序列为TCAACCCCTAAGCACAGCTTAC。

全文数据：一种Khuskiaoryzae的检测方法技术领域本发明属于喷气燃料污染微生物检测技术领域，具体涉及一种检测喷气燃料中特征真菌Khuskiaoryzae的方法。背景技术有研究发现Khuskiaoryzae是造成储备喷气燃料中的悬浮物的主要原因之一，而悬浮物是影响喷气燃料洁净性的一个重要指标。实际油库调查研究发现，被真菌污染的喷气燃料中发现了Khuskiaoryzae的影子。Khuskiaoryzae是一种常见的丝状真菌，嗜干燥，适合在喷气燃料中成长。目前，国际航空运输协会TheInternationalAirTransportAssociation，IATA推荐了4种检测方法针对飞机油箱中的微生物，但是针对Khuskiaoryzae特异性检测的方法没有，MicrobMoiter2、EasicultCombi是一种运用培养基培养微生物的定量评估方法，耗时长，而且Khuskiaoryzae在普通培养基上生长具有局限性。FUELSTATTMresinae是一种免疫检测法，定性评估真菌污染情况，虽然检测时间短但成本高并且操作复杂。HY-LiTEJetA1用来对燃料和水中的总ATP进行定量检测，特异性差。且上述四种方法均为国外专利，在国内应用较少。环介导等温扩增LAMP是一种已经发展较为成熟新型的核酸扩增方法，该方法针原理为，针对靶基因的6个区域设计出4种特异引物，利用一种链置换活性的BstDNA聚合酶在等温条件63℃左右孵育30-60分钟，即可完成核酸扩增反应，可使目的DNA在短时间内从数份扩增至109份。横向流试纸条LFD的出现使LAMP扩增结果可视化得以实现，并做到了快速、简单。LAMP-LFD方法原理为：FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，扩增反应结束后，将试纸条浸入到包含有扩增产物和缓冲液的混合物中即可，操作简便、安全。LAMP-LFD结合技术可以用肉眼直接观察检测结果，LFD试纸条上有控制线和检测线，如果两条线均显色，则表明检测结果为阳性，若只有控制线显色而检测线不显色则表明检测结果为阴性。LAMP-LFD方法，简便、灵敏、特异性高，不依赖特殊检测设备，能够满足现场检测等方面的使用需求，极具推广前景。本文中，我们建立了一种LAMP-LFD快速灵敏的检测Khuskiaoryzae新方法。发明内容本发明的目的是提供一种快速检测喷气燃料中特征真菌Khuskiaoryzae的方法，从而弥补现有技术的不足。本发明提供一种检测真菌Khuskiaoryzae的LAMP引物组，包括有：F3引物A-F3:5′-GGTTCTGGCATCGATGAAGA-3′SEQIDNO:1、B3引物A-B3：5′-AGAGGACTACTGCCACTCC-3′SEQIDNO:2、FIP引物A-FIP:5′-TGGGCGCAATGTGCGTTCAAACGCAGCGAAATGCGATA-3′SEQIDNO:3、BIP引物A-BIP:5′-CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATACGGAGGCCGTAGAGTC-3′SEQIDNO:4、LF引物A-LF:5′-GATTCGATGATTCACTGAATTCTGC-3′SEQIDNO:5LB引物A-LB:5′-TCAACCCCTAAGCACAGCTTAC-3′SEQIDNO:6；作为优选，A-FIP的序列如下:5′-TGGGCGCAATGTGCGTTCAATTACGCAGCGAAATGCGATA-3′SEQIDNO:7、A-BIP的序列如下:5′-CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATTTACGGAGGCCGTAGAGTC-3′SEQIDNO:8。其中A-FIP为5′端进行生物素标记，A-LF的5′端进行异硫氰酸荧光素FITC标记；本发明还提供一种检测有害Khuskiaoryzae的方法，包括如下的步骤1配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：各0.2μmolL的F3及B3，各1.6μmolL的FIP及BIP，各0.8μmolL的LF及LB，甜菜碱0.8molL，1.4mmolL的dNTPs，20mmolLTris-HClpH8.8，KCl10mmolL，MgSO48mmolL，Tween200.1％，NH42SO410mmolL，BstDNA聚合酶8U，基因组DNA模板2μL，超纯水定容至25μL。2LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行核酸扩增反应，扩增反应所需温度为61℃-65℃，扩增反应所需时间为30min-60min。3LFD检测：取8μL核酸扩增产物将产物加入到100μLBuffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果。步骤2中所述的最适反应温度为65℃，最适反应时间为60min本发明LAMP-LFD方法检测Khuskiaoryzae相对于传统PCR方法，不仅做到了结果可视化，还具有特异性强、操作简单、耗时短、灵敏度高以及不依赖昂贵的特殊仪器的特点。运用本发明的方法对储备中的喷气燃料进行检测，能更好地提高了特征真菌污染喷气燃料的预警能力，这对保障喷气燃料质量及飞机的飞行安全有着重要的意义。附图说明图1：PCR-AGE检测Khuskiaoryzae的灵敏度图、图2：LAMP检测Khuskiaoryzae的灵敏度图、图3：LAMP-LFD检测微Khuskiaoryzae灵敏度图、图1和图3中，泳道M为DL2000DNAmarker,NC为阴性对照，0号泳道为100模板浓度23ngμL,1-8号泳道依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释的基因组DNA。图4：PCR-AGE检测Khuskiaoryzae的特异性图、图5：LAMP检测Khuskiaoryzae的特异性图、图6：LAMP-LFD检测Khuskiaoryzae的特异性图；在图4和图6中，泳道M为DL2000DNAmarker,NC为阴性对照，1-6泳道依次为：Khuskiaoryzae、局限青霉、帚状曲霉、枝孢霉菌、绿色木霉菌以及出芽短梗霉。具体实施方式LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术Loop-mediatedisothermalamplification与横向流动试纸条Lateralflowdipstick相结合的一种新颖的微生物检测技术，该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测相结合。环介导等温扩增技术LAMP，只需要在恒温60℃–65℃条件下恒温几十分钟，即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条LFD，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，可特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术LAMP与横向流动试纸条LFD相互结合的技术，使LAMP扩增产物现场检测得以实现，检测结果明显直观，可视化。LAMP-LFD方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度、高特异性且仪器依赖程度低，具有其他技术所无法替代的优势。本发明根据上述LAMP-LFD原理，将技术方案分为以下三个部分：1、设计合成3对用于Khuskiaoryzae的LAMP扩增引物，即A-F3和A-B3、A-FIP和A-BIP以及A-LF和A-LB，长度分别为20bp、19bp、40bp、39bp、21bp和22bp的寡核苷酸序列；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；3、将A-LF设计为DNA探针，结合LFD技术对LAMP扩增结果进行分析以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述本实验所用6种帚状曲霉AspergilluspenicillioidesCICC2153、枝胞霉菌Cladosporiumresinae、局限青霉PeniclliumrestrictumCICC40688、绿色木霉菌TrichodermavirideCGMCC3.3875、出芽短梗霉AureobasidiumpullulansCGMCC3.2942以及KhuskiaoryzaeCGMCC3.8851，除枝孢霉为实验室从喷气燃料中分离保存之外，其余皆由中国工业微生物保藏管理中心CICC以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC提供。以上菌种均选用沙保氏液体培养基培养，放置于摇床培养4d，温度为25℃。沙保氏液体培养基的制备简述：4g葡萄糖、1g蛋白胨加入100mL的去离子水中混匀，125℃高压灭菌20min，贮存备用。实施例1:LAMP-LFD技术检测喷气燃料中污染真菌Khuskiaoryzae的方法建立1.1材料与方法1.1.1材料TakaraMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.50购置宝生物工程大连有限公司脱氧核糖核酸扩增试剂盒，荣研生物科技中国有限公司，LFD检测试纸条购自MileniaBiotecGmbH公司MileniaGenLineHybriDetectMGHD1，Germany1.1.2方法1.1.2.1LAMP引物的设计根据Khuskiaoryzae的ITS基因序列设计和筛选出下面3对引物，引物序列如下所示：A-F3:5′-GGTTCTGGCATCGATGAAGA-3′A-B3：5′-AGAGGACTACTGCCACTCC-3′A-FIP:5′-TGGGCGCAATGTGCGTTCAAACGCAGCGAAATGCGATA-3′A-BIP:5′-CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATACGGAGGCCGTAGAGTC-3′A-LF:5′-GATTCGATGATTCACTGAATTCTGC-3′A-LB:5′-TCAACCCCTAAGCACAGCTTAC-3′其中A-FIP的5′端生物素标记引物，A-LF为5′端用异硫氰酸荧光素FITC标记。按照上述引物序列，在大连宝生物公司进行LAMP引物合成。1.1.2.2LAMP扩增条件优化以Khuskiaoryzae的基因组DNA作为模板进行扩增条件优化。LAMP法DNA扩增反应试剂盒购自博奥生物科技有限公司。首先配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应体系为：各引物浓度为：各0.2μmolL的F3及B3，各1.6μmolL的FIP及BIP，各0.8μmolL的LF及LB，甜菜碱0.8molL，1.4mmolL的dNTPs，20mmolLTris-HClpH8.8，KCl10mmolL，MgSO48mmolL，Tween200.1％，NH42SO410mmolL，BstDNA聚合酶8U，基因组DNA模板2μL，超纯水定容至25μL。LAMP-LFD反应体系见表1。表1：LAMP-LFD反应体系未确定获得最佳LAMP扩增效率，并综合考虑LFD适用条件，应用本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系，分别在三分不同温度61℃、63℃、65℃条件下进行LAMP扩增反应，通过实时浊度仪对扩增反应进行实时监控，最终确定最佳反应时间和温度。通过实验结果分析最终选择65℃，60min作为后续LAMP扩增的最佳反应条件。1.2.2.3LFD检测LAMP扩增结束后，取8μL扩增产物加入到100μLBuffer溶液中混匀，将LFD试纸条垂直浸入混合液中，观察试纸条检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品中Khuskiaoryzae的检测结果为阳性，如果不显色则表示该样品Khuskiaoryzae的检测结果为阴性。实施例2用本发明的LAMP-LFD技术对Khuskiaoryzae灵敏度进行测定1、参照广州迪澳生物工程有限公司通用DNA提取试剂盒要求提取Khuskiaoryzae基因组DNA，将所提取的Khuskiaoryzae的基因组DNA模板8.2ngμL按10倍梯度稀释至10-8，分别做为LAMP、LAMP-LFD和PCR反应模板。2、用LAMP、LAMP-LFD和PCR法对Khuskiaoryzae进行检测比较灵敏度。2.1上述梯度稀释后的基因组DNA作为LAMP反应的模板进行扩增，按照优化的LMAP反应体系及引物进行LAMP扩增反应，用本发明提供的LFD方法分析LAMP反应，结果见图3。2.2将上述梯度稀释的基因组DNA用作LAMP的模板进行核酸扩增试验，结果见图2。2.3将上述梯度稀释的基因组DNA用作PCR反应模板，利用上述特异引物A-F3和A-B3进行扩增，反应体系为：20μmolLF3和20μmolLB3各1μL，PremixTaq酶TaKaRa25μL，KhuskiaoryzaeDNA模板3μL，超纯水定容至50μL体系。优化后的PCR反应条件：预变性95℃5min；95℃40s，53℃40s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图1。实验结果表明，LAMP-LFD检测的最低稀释浓度为10-5，模板浓度为230fgμL；LAMP最低检测线为2.3pgμL；PCR扩增最低浓度为2.3pgμL。LAMP-LFD检测的灵敏度比为PCR的10倍，上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。实施例3用本发明的LAMP-LFD技术对Khuskiaoryzae特异性进行测定选取帚状曲霉Aspergilluspenicillioides、枝胞霉菌Cladosporiumresinae、局限青霉Peniclliumrestrictum、绿色木霉菌Trichodermaviride、出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans以及Khuskiaoryzae6种常见喷气燃料污染真菌为LAMP-LFD特异性试验菌，其中超纯水为阴性对照。提取真菌的基因组DNA，扩增产物分别用LFD试纸条和1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。检测结果见图4-6，说明本发明提供的Khuskiaoryzae的LAMP-LFD检测方法能保证对Khuskiaoryzae的特异性检测，不与其他喷气燃料中污染真菌交叉反应。为了提高检测时的灵敏度，申请人对设计的引物进行了优化，优化后的A-FIP的序列如下:5′-TGGGCGCAATGTGCGTTCAATTACGCAGCGAAATGCGATA-3′SEQIDNO:7、A-BIP的序列如下:5′-CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATTTACGGAGGCCGTAGAGTC-3′SEQIDNO:8。使用上述优化后的引物，LAMP-LFD可以检测的LAMP最低检测线为1.6±0.2pgμL；PCR扩增最低浓度为2.0pgμL；在检测的灵敏度上有明显的提高。实施例4LAMP-LFD对不同油库喷气燃料中真菌的检测应用用1.1.2.2中的试剂盒法提取各样品的DNA模板。并用已经设计好的LAMP-LFD方法检测喷气燃料样品中是否存在Khuskiaoryzae；同时利用培养基方法进行微生物分离鉴定。每次试验三组平行，检测结果如表2所示。表2：LAMP-LFD与培养基法对不同油库喷气燃料样品的检测结果注：+.阳性；—.阴性上述结果表明本发明的引物组及检测方法所获得的结果与培养基方法的结果一致，证明了本发明的可靠性。

权利要求：1.一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：F3，序列为GGTTCTGGCATCGATGAAGA、B3，序列为AGAGGACTACTGCCACTCC、FIP，序列为TGGGCGCAATGTGCGTTCAAACGCAGCGAAATGCGATA、BIP，序列为CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATACGGAGGCCGTAGAGTC、LF，序列为GATTCGATGATTCACTGAATTCTGC、LB，序列为TCAACCCCTAAGCACAGCTTAC。2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的FIP的序列为TGGGCGCAATGTGCGTTCAATTACGCAGCGAAATGCGATA。3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的BIP的序列为CTAGTGGGCATGCCTGTTCGATTTACGGAGGCCGTAGAGTC。4.如权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述的FIP的5′端用生物素标记。5.如权利要求1或3所述的引物组，其特征在于，所述LF的5′端用FITC标记。6.权利要求1所述的引物组在检测Khuskiaoryzae中的应用。

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