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申请/专利权人：浙江海洋大学

摘要：本发明公开了一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，包括，1利用EPIC基因序列全长设计通用引物，对石首鱼科不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序；2利用线粒体COI基因对不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序；3对步骤1和步骤2的扩增产物进行比对，计算石首鱼科不同属代表种的序列变异、碱基组成及遗传距离，判断石首科鱼类的系统发育关系。有益效果为：本发明分子标记利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好。

主权项：1.一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：将EPIC DNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。

全文数据：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记技术领域本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记。技术背景Exon-primedintron-crossingEPIC是指由基因的外显子DNA序列作为引物，通过PCR扩增、测序等来检测内含子的多态性，与传统的分子标记相比，EPIC是一种新型的遗传标记，具有一些不同的特点。由于内含子比较保守，因此利用EPIC设计引物时，选取其中最为保守的序列，这在种间、甚至属间，都具有较好的通用性。另外，EPIC内含子标记不容易引起由引物结合位点的缺失、插入或突变而导致PCR扩增出现问题，因此，相对于微卫星分子标记，等位基因扩增丢失和无效等位基因的概率较低。EPIC标记的开发得到推广来并已经应用到不同的鱼类的研究中，但是在开发EPIC标记时，值得注意的是，作为标记的内含子序列，长度一定要适合，如果内含子序列过长，可能导致PCR无法成功扩増，失去多态性分析的意义。另外，只有该物种或亲缘关系巧近的物种的全基因组序列和cDNA序列具备的情况下，才能找到EPIC序列的外显子与内含子界限，送一条件某种程度上限制了研究材料，而没有分子生物学研究背景的材料更难于进行。最后，在利用EPIC标记进行遗传分析时，该物种基因組内基因复制及其造成的影响也是需要考虑的。石首鱼科Sciaenidae隶属鲈形目，在全世界范围内共有70个属300余种，是鲈形目中属种最多的科之一。我国沿海石首鱼类种属众多，共有17个属30多种。石首鱼科的绝大多数种类肉味鲜美、经济价值高，是海洋渔业和海水养殖的重要对象。石首科鱼类是我国海洋经济鱼类中产量最大的类群之一，是中国重要的海洋经济鱼类。石首鱼的系统发育关系仍纷繁复杂，有待于用更多的分子手段、方法来进一步理顺及验证。而利用核基因序列内含子多态性EPIC序列全长设计通用引物，对石首鱼科不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序并对各序列进行一系列生物学信息分析，同时对序列进行了同源性比对分析和系统进化树的构建；初步确定了该内含子在石首科鱼类的标记作用，并根据这种研究结果将为石首科鱼类的种质资源保护提供一定的理论基础。发明内容本发明的目的在于提供一种操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记。本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。本发明EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势，利用EPIC，从一个新的角度，利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，根据扩增出的外显子及内含子序列判断它们的系统发育关系，具有外显子的保守性以及内含子的高进化速度的优点，且核基因由于长度适中、易于扩増、进化速度快、变异性高，在基因组中含有丰富的遗传信息，为探讨石首鱼类分子系统发育关系做进一步尝试。作为优选，线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备；2COI基因PCR扩增和测序；PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’。进一步优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。进一步优选，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。作为优选，利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备；2PCR扩增和测序。作为优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。进一步优选，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。作为优选，PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP。进一步优选，虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。该虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的合理比例能够发挥增益作用，不仅能与虾碱性磷酸酶反应底物中的有机磷或者水解生成的磷酸根络合，避免磷的存在而影响虾碱性磷酸酶的活性，而且还可以与虾碱性磷酸酶中的活性部位结合而提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，能够得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。更进一步优选，消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势；本发明利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，能够得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。该EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势，利用EPIC，从一个新的角度，利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，根据扩增出的外显子及内含子序列判断它们的系统发育关系，具有外显子的保守性以及内含子的高进化速度的优点，且核基因由于长度适中、易于扩増、进化速度快、变异性高，在基因组中含有丰富的遗传信息，为探讨石首鱼类分子系统发育关系做进一步尝试。上述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备a.取冰冻组织300mg，用小剪刀剪至肌肉组织呈粉末状，并转入2ml的Eppendorf管中，放入电热鼓风干燥箱，50℃干燥10min使组织中酒精完全挥发；b.将EP管取出，加入550ul组织裂解液EDTA:SDS＝10:1比例预先配好，然后分别加入30ul蛋白酶K和5ulRNA酶，震荡3min后，转入恒温水浴锅中，55℃裂解5h，期间每隔30min颠倒混匀一次；c.取出EP管，转至超净工作台，冷却至室温，加入500ul平衡酚4℃预冷，缓慢颠倒10min，使组织液与平衡酚充分混匀；d.将EP管转入离心机中，12000rpm常温离心10min，转上层水相于新的EP管中；e.向EP管中加入4℃预冷的酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min，并转上层水相于新EP管中；f.向EP管中加入氯仿:异戊醇＝24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min；g.转上层水相于新的EP管中，加入50ul的NaAc浓度＝3molL，pH＝5.2，同时加入1000ul于超低温冰箱预冷-20℃的无水乙醇，彻底颠倒混匀10min，然后放置在超低温冰箱-20℃沉淀1-2h；h.此时已经可以观察到DNA絮状沉淀，于10000rpm离心15min，弃去上清液；i.向EP管中加入1000ul浓度为70％的冷乙醇4℃，并于10000rpm离心20min，使DNA沉淀在EP管底部，倒掉上清液，于室温敞口放置直至可见的乙醇挥发殆尽；向EP管中加入100ulTE缓冲液，放入超低温冰箱-20℃保存，静置一天以上方可使用，使DNA完全溶解；2COI基因PCR扩增和测序；PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’；PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min；3PCR产物的纯化经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，符合预期片段长度的目的条带，进行产物纯化，即切胶回收，切胶回收实验方法按照康为世纪公司生产的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒GelExtractionKit进行纯化实验，具体操作步骤如下：a将单一目的产物条带从琼脂糖凝胶中切下尽量切除多余部分，放入干净的离心管中，称取重量；b向胶块中加入3倍体积BufferPG；c3.50℃孵育10min，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解；d加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀；e柱平衡：向已装入收集管CollectionTube中的吸附柱SpinColumnDM中加入200ulBufferPS，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；f将步骤c或者步骤d中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；g向吸附柱中加入500ulBufferPG，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；h向吸附柱中加入650ulBufferPW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；i12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；j将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul-50ulBufferEBpH8.5，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集产物溶液，-20℃保存溶液。5将经1.0％琼脂糖电泳检测后的PCR产物送生物公司测序，并辅以人工校正。上述利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备：同线粒体COI基因序列及检测步骤中DNA；2PCR扩增和测序引物参考Lietal.2010，由南京金斯瑞生物股份有限公司合成，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。为了消化PCR反应体系中剩余的dNTP，PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP。其中，虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4；消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。该虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的合理比例能够发挥增益作用，不仅能与虾碱性磷酸酶反应底物中的有机磷或者水解生成的磷酸根络合，避免磷的存在而影响虾碱性磷酸酶的活性，而且还可以与虾碱性磷酸酶中的活性部位结合而提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，能够得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，得到的DNA浓度及纯度都符合PCR要求。通过测序，分别得到了大黄鱼、小黄鱼棘头梅童鱼、黄姑鱼、白姑鱼、叫姑鱼、鮑鱼、日本银姑鱼及眼斑拟石首鱼的线粒体COI基因系列及9个EPIC核基因共4141bp。通过DNAstar软件比对，对线粒体COI基因系列进行分析，9个石首鱼物种间，共有2％个多态位点及9个单倍型。单倍型多样性Hd为1.000，单倍型方差差异为化0.00274，标准偏差的单体型的多样性为化0.050，核苷酸多样性为0.178。对于核基因DNA序列进行分析，9个石首鱼物种问，共有1083个多态位点及9个单倍型。单倍型多样性Hd为1.000，单倍型方差差异为化0.00274，标准偏差的单体型的多样性为化0.048，核昔酸多样性为化0.1045。对线粒体COI基因DNA进行分化碱基组成分别为28.8％A，29.5％C，22.8％G和18.9％T，A+T比重51.6％比C+G比重略高。对核基因序列进行分析，碱基组成分别为30.8％A，22.3％C，26.8％G和20.1％T，A+T比重57.6％比C+G比重略高。实施例2：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。上述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备；2COI基因PCR扩增和测序：PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’；PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。上述利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备；2PCR扩增和测序：PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，其中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.8；消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，得到的DNA浓度及纯度都符合PCR要求。实施例3：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。上述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备；2COI基因PCR扩增和测序：PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’；PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。上述利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备；2PCR扩增和测序：PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，其中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:4.2；消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，得到的DNA浓度及纯度都符合PCR要求。对比例1：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。上述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备；2COI基因PCR扩增和测序：PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’；PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。上述利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备；2PCR扩增和测序：PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA条带稍有有拖尾现象，说明得到的DNA不太符合PCR要求，同时也而进一步说明虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝能够消化PCR反应体系中剩余的dNTP，得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表浙江海洋大学一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记2SIPOSequenceListing1.0126DNA人工序列ArtificialSequence1tcatccaacgacaaacgaattggcat26225DNA人工序列ArtificialSequence2tagacttgtggcttgccgaatatca25

权利要求：1.一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。2.根据权利要求1所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1DNA模板的制备；2COI基因PCR扩增和测序；所述PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’。3.根据权利要求2所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。4.根据权利要求2所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。5.根据权利要求1所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述利用EPICDNA序列检测步骤为：1DNA模板的制备；2PCR扩增和测序。6.根据权利要求5所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5UulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。7.根据权利要求5所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。8.根据权利要求2或5所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP。9.根据权利要求8所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。10.根据权利要求8所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。

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