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申请/专利权人：贵州民族大学人文科技学院

摘要：本发明公开了一种川东灯台报春的离体保存方法，该方法适用于濒危植物川东灯台报春的离体保存，属植物生物技术领域。本发明以川东灯台报春无病害叶片为外植体，通过愈伤组织诱导及分化、离体保存、恢复生长、生根培养等一系列步骤，极大的提高了川东灯台报春的繁殖速度，同时使得离体保存时间可长达210d以上，使濒危植物川东灯台报春得到优良的繁殖技术方法及持续种源，避免其走向极度濒危至灭绝的境地。因野外该植物已处于濒危状态，数量极少，本发明利用其叶片为外植体，极大减小了对母株的损害，且繁殖速度快，1个月繁殖系数为8‑15，生根率约90%‑95%，移栽成活率约为93%‑95%，极大地提高了川东灯台报春的繁殖速度，解决了其种子少，野外植株少，繁殖困难的濒危现状。

主权项：1.一种川东灯台报春的离体保存方法，过程为采集川东灯台报春无病害叶片，经常规表面消毒，将叶片在超净工作台上切成5mm*5mm的小块，接种在愈伤组织诱导培养基1上，待愈伤长出后，切成小块，转接至分化培养基2，经分化培养基获得芽苗，将芽苗转接在离体保存培养基3中，如需恢复生长，将离体保存的小苗转接至恢复培养基4中，培养30天后，切成一心一芽转接至生根培养基（5）中进行生根，培养20‑30天后进行常规炼苗后移栽。

全文数据：一种川东灯台报春的离体保存方法技术领域本发明涉及生物技术领域中植物组织培养方法，具体地说，涉及一种濒危植物川东灯台报春的离体保存方法。背景技术川东灯台报春Primulamallophylla属于报春花科报春花属植物。川东灯台报春的模式标本由英国人P.Farges于19世纪末期在川东城口区（今重庆市城口县）大巴山地区首次采集，并存放于法国巴黎植物标本馆，后被以不同的种名保存于英国邱园及爱丁堡植物园的标本馆。1916年，植物学家I.B.Balfour根据这些标本材料认定了“川东灯台报春”新种。由于此后再没有植物学家采集到该种植物，所以在2004年出版的《中国红色名录》将其列入“灭绝（EX）”类。2006年，中科院昆明植物研究所张长芹老师在野外发现的该物种，同时根据国际通用的“红色名录等级及标准”，对其濒危等级进行了评估，认为川东灯台报春现在的状况为濒危（EN）。该植物花玫瑰紫色，花色艳丽，具有较高的观赏价值。据观察发现，该植物在野外生殖隔离严重，很少结实，种子缺乏。ZL201010199342.2利用其茎尖为外植体对组培繁殖方面有相关的一些研究与报道，因该物种目前属于濒危状况，而以茎尖为外植体，势必会对其母体造成损害，更加剧了其稀少的现状，以叶片为外植体，则很好的解决了这个问题，目前尚缺乏以叶片为外植体进行组培及离体保存技术方面的研究。离体保存技术正日益成为种质资源保存的常用手段。利用继代培养的方法进行种质保存，存在的突出问题就是草本植物继代周期短，需要频繁的进行继代转接才能保存该物种。且随着继代次数的增加，材料会出现不同程度的变异，同时，扩繁材料越来越多，导致人力和物力成本不断升高。为了使川东灯台报春在有性繁殖困难的基础上，能成功进行扩繁并能较长的保存其离体组织，缓解其濒危现状，需要研究该种的离体保存方法，并形成一套专门的离体保存技术体系。发明内容本发明的目的是提供一种濒危植物川东灯台报春离体保存方法，使之在生殖隔离严重的情况下能够持续繁衍且使该物种的保存能够得到保障，减少继代次数，增加离体保存时间，为濒危川东灯台报春的物种保护及可持续利用奠定基础。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：一种川东灯台报春离体保存方法，包括外植体选取、愈伤组织诱导及分化、离体保存、恢复生长、生根培养一系列过程。取川东灯台报春无病害叶片为外植体，进行常规外植体消毒。材料在流动的自来水下清洗20min后转移至超净台，用75%的酒精消毒15-20s，无菌水冲洗3-5遍后，用质量浓度0.1%升汞溶液进行表面消毒6-9min，将消毒后的材料用无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面水分，将其在超净台上切成0.5cm*0.5cm的方块材料叶面向上平铺于诱导培养基1：MS+2mgL6-BA+0.8mgLTDZ+1.0mgLIAA，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，暗培养7天后，转至光照时间为10hd条件下。待愈伤组织长出后，将其切成小块转接至分化培养基2：MS+6-BA1.0mgL+KT0.5mgL+NAA0.05mgL，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，光照时间为10hd，培养20-30天。待芽苗分化，将其分切开转接至离体保存培养基3：12MS+PPP3331.5mgL+NAA0.05mgL，如需恢复生长，则将离体保存苗转接至恢复生长培养基4为MS+1mgL6-BA+0.1mgLIAA。恢复生长20-30天后，转接至生根培养基5进行生根：12MS+NAA0.05mgL。其中1、2、4和5添加蔗糖25gL，3添加蔗糖40gL，活性炭1-2gL；所有培养基均添加琼脂6gL-7gL，pH5.8，在如下培养条件下培养：培养温度23±2℃，光照强度1500LUX-2000LUX，光照时间1、2、3、4为10hd，5为12hd；培养基添加量1、2、4、5为45ml，培养基3为75ml。移栽时，小苗在瓶内生长至2-3cm高，有3-5片叶片，茎粗达到1mm-1.2mm，有浓密须根后进行炼苗移栽。移栽基质为混合泥炭土1份+红土1份，大棚温度为20-30℃，湿度为40%-60%。本发明相对现有技术的有益效果为：1.目前川东灯台报春的组培快繁仅有少数报道，且采用的外植体是茎尖，对濒危植物来说，损伤较大。本发明采用的外植体为叶片，极大的减小了对母株的伤害；2.此发明离体保存的培养基，可使该品种在瓶内无继代存活210d以上，降低了继代转接次数，很好的保存了该种的无性系，目前还没有离体保存方面的报道。下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点，但不以此来限定本发明。具体实施方式方法实施例1：取川东灯台报春无病害叶片为外植体，材料在流动的自来水下清洗20min后转移至超净台，用75%的酒精消毒20-30s，无菌水冲洗3-5遍后，用0.1%升汞溶液进行表面消毒6-9min，将消毒后的材料用无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面水分，将其在超净台上切成0.5cm*0.5cm的方块材料待用。将切好的叶片叶面向上平铺于愈伤组织诱导培养基：MS+2mgL6-BA+0.8mgLTDZ+1.0mgLIAA，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，暗培养7天后，转至光照时间为10hd条件下。待愈伤组织长出后，将其切成小块转接至分化培养基：MS+6-BA1.0mgL+KT0.5mgL+NAA0.05mgL，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，光照时间为10hd，培养20-30天。待芽苗分化，将其分切开转接至离体保存培养基：12MS+PPP3331.5mgL+NAA0.05mgL，pH5.8，蔗糖40gL，活性炭1-2gL，琼脂6-7gL，每瓶灌装75ml培养基，在此培养基可长期保存210d以上。待210d以后，可再次进行转接至该培养基继续保存。如需恢复生长，则将离体保存苗转接至恢复生长培养基为MS+1mgL6-BA+0.1mgLIAA，琼脂6-7gL，pH5.8。恢复生长20-30天后，转接至生根培养基进行生根：12MS+NAA0.05mgL，光照时间为12hd，培养20-30天，须根长出即可进行炼苗移栽。移栽时，小苗在瓶内生长至2-3cm高，有3-5片叶片，茎粗达到1mm-1.2mm，有浓密须根后进行炼苗移栽。移栽基质为混合泥炭土1份+红土1份。大棚温度为20-30℃，湿度为40%-60%，30天后统计成活率约为95%。方法实施例2：步骤（1）：选取川东灯台报春母株上无病害叶片，用消毒剪刀剪下带回实验室。将材料在流动的自来水下冲洗10min。后将材料用洁净的容器盛放带至超净工作台，采用75%的酒精灭菌15s，无菌水冲洗4遍后，用质量浓度为0.1%升汞溶液表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0.1%升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用；步骤（2）：用无菌滤纸吸干步骤（1）消毒后材料表面水分，将其在超净台上切成0.5cm*0.5cm的方块材料待用；步骤（3）：将步骤（2）切好的材料叶面向上平铺于诱导培养基：MS+2mgL6-BA+0.8mgLTDZ+1.0mgLIAA，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，暗培养7天后，转至光照条件10hd，光照强度1500LUX-2000LUX，温度23±2℃的条件下培养20-30天，可见愈伤组织长出，呈黄绿色团状；步骤（4）：将步骤（3）发出的愈伤组织切成小块，转接至分化培养基：MS+6-BA1.0mgL+KT0.5mgL+NAA0.05mgL，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL中，光照条件10hd，光照强度1500LUX-2000LUX，温度23±2℃，培养20-30天，可见有绿色的小芽苗分化；步骤（5）：将步骤（4）得到芽苗转接至离体保存培养基进行保存：12MS+PPP3331.5mgL+NAA0.05mgL，pH5.8，蔗糖40gL，琼脂6-7gL，培养基灌装75ml，光照强度1500LUX-2000LUX，温度23±2℃，可培养210d以上无需转接；步骤（6）：如需要恢复生长，将其转入MS+1mgL6-BA+0.1mgLIAA，pH5.8，蔗糖25gL，琼脂6-7gL，光照强度1500LUX-2000LUX，光暗时间10h14h，恢复培养基后可100%进行增殖生长；步骤（7）：将恢复生长的小苗，转接至生根培养基：12MS+NAA0.05mgL，培养20-30天，光照强度1500LUX-2000LUX，温度23±2℃，光照时间为12hd，须根长出即可进行炼苗移栽。移栽时，小苗在瓶内生长至2-3cm高，有3-4片叶片，有须根后进行炼苗移栽。移栽基质为混合泥炭土1份+红土1份。大棚温度为20-30℃，湿度为40%-60%，30天后成活率统计约为93%。

权利要求：1.一种川东灯台报春的离体保存方法，过程为采集川东灯台报春无病害叶片，经常规表面消毒，将叶片在超净工作台上切成5mm*5mm的小块，接种在愈伤组织诱导培养基1上，待愈伤长出后，切成小块，转接至分化培养基2，经分化培养基获得芽苗，将芽苗转接在离体保存培养基3中，如需恢复生长，将离体保存的小苗转接至恢复培养基4中，培养30天后，切成一心一芽转接至生根培养基（5）中进行生根，培养20-30天后进行常规炼苗后移栽。2.如权利要求1所述的一种川东灯台报春的离体保存方法，其特征在于所述的培养基如下：1愈伤组织诱导培养基：MS+2mgL6-BA+0.8mgLTDZ+1.0mgLIAA；2分化培养基：MS+6-BA1.0mgL+KT0.5mgL+NAA0.05mgL；3离体保存培养基：12MS+PPP3331.5mgL+NAA0.05mgL；4恢复生长培养基：MS+1mgL6-BA+0.1mgLIAA（5）生根培养基：12MS+NAA0.05mgL。3.如权利要求1所述的一种川东灯台报春的离体保存方法，其特征在于所述的以上培养基1、2、4和5添加蔗糖25gL，3添加蔗糖40gL，活性炭1-2gL；所有培养基均添加琼脂6gL-7gL，pH5.8，培养温度23±2℃，光照强度1500LUX-2000LUX，光照时间1、2、3、4为10hd，5为12hd；培养基灌装量1、2、4、5为45ml，培养基3为75ml。

百度查询： 贵州民族大学人文科技学院 一种川东灯台报春的离体保存方法