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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开了抑制SRSF6基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法，所述的shRNA序列为F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'，R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述慢病毒表达载体是将上述的shRNA插入载体质粒PLKO.1中,构建PLKO.1‐SRSF6‐shRNA；载体测序验证正确后将其和包装质粒PSPAX2和PMD2.G中转染HEK293T细胞获得慢病毒悬液；用此悬液去感染结直肠癌细胞,然后用嘌呤霉素筛选验证病毒包装是否成功；Western Blot验证其能明显降低SRSF6的表达水平；并能显著降低结直肠癌细胞的增殖能力和迁移侵袭能力；其中SRSF6对肿瘤细胞迁移侵袭能力的作用的研究尚数首次。

主权项：1.一种慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有人的SRSF6的基因干扰片段,其特征是该载体为PLKO.1‐SRSF6‐shRNA,该载体中包含的shRNA序列是F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述的载体构建方法如下：合成上述shRNA序列对应的DNA寡核苷酸序列，a取等量100mmolL的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液中加热到95℃，5分钟，缓慢降至室温，得到插入片段；b用AgeI、EcoR I双酶切PLKO.1表达载体3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体骨架，T4连接酶将插入片段和载体骨架连接。

全文数据：一种靶向SRSF6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用技术领域本发明属于分子生物学领域，涉及一种shRNA的构建及应用。具体来说，本发明针对人SRSF6基因的mRNA序列设计合成shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后能抑制所述肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭。背景技术RNA剪接RNAsplicing：从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。最终形成成熟的mRNA还包括5’末端的加帽加上m7‐Gppp,以及在3’末端多聚腺昔酸化。在真核生物中,平均每个细胞基因包含约8个内含子,前体mRNA的长度通常为成熟mRNA的4‐10倍,绝大多数部分在加工过程中被切除。在RNA剪接过程中，SR蛋白家族成员发挥了至关重要的作用。SR蛋白家族成员都具有一个富含丝氨酸精氨酸SR重复序列的RS结构域,在RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程中具有重要的作用。绝大多数SR蛋白是生存的必需因子,通过其RS结构域和特有的其他结构域,实现与前体mRNA的特异性序列或其他剪接因子的相互作用,协同完成剪接位点的正确选择或促进剪接体的形成。同时SR蛋白家族成员也在RNA的转运，RNA的降解等方面发挥着重要作用。SRSF6属于SR蛋白家族一员，同样可以对RNA前体进行选择性剪接。在肿瘤领域内，SRSF6会促进皮肤癌的异常增生，是一个癌基因[MadsAJensen，etal..SplicingfactorSRSF6promoteshyperplasiaofsensitizedskin.naturestructural&molecularbiology.VOLUME21NUMBER2.FEBRUARY2014.]。在结肠癌和肺癌中，SRSF6同样可以促进肿瘤细胞的增殖[JensenMA，etal..ThesplicingfactorSRSF6isamplifiedandisanoncoproteininlungandcoloncancers.VOLUME229NUMBER2.MARCH2013.]。发生转移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征，也是影响患者生存和预后的关键因素，结直肠癌不仅发病率高且在中晚期极易发生转移，成为治疗失败的主要原因。肿瘤转移是由肿瘤细胞的迁移和侵袭能力决定的。而目前关于SRSF6在结直肠癌转移方面的研究还是一片空白。本发明首次证实了SRSF6对结直肠迁移和侵袭方面的作用，这也是SRSF6对所有肿瘤细胞迁移侵袭方面功能的首次验证。总之，本发明构建了针对SRSF6的shRNA，所述shRNA转入结直肠癌细胞后，发现有效抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径。发明内容本发明针对结直肠癌肿瘤细胞致病性最重要的两个因素增殖和转移，构建了一种shRNA。这种shRNA是基于PLKO系统设计包装完成的。其正义链和反义链的序列分别为：F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'。所述shRNA能够降低结直肠癌肿瘤细胞中SRSF6的蛋白含量。而且能够抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖和迁移。本发明是根据PublicTRCPortal网站，针对人SRSF6基因设计出的一条shRNA。阴性对照选取系统自动匹配的scramble序列。本发明shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止采用T5结构。正义链的5’端添加了CCGG，与AgeI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5′端添加了AATTCAAAAA，与EcoRI酶切后形成的粘端互补，序列如下；F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'本发明将上述设计的SRSF6‐shRNA、scramble的寡核苷酸常规退火后合成双链，并连接到AgeI、EcoRI双酶切后PLKO.1表达载体上，将连接产物转化大肠杆菌。挑取单菌落进行测序鉴定，得到了阳性的克隆和质粒。本发明将PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble表达载体分别进行重组慢病毒的包装，包装质粒为PSPAX2和PMD2.G。包装过程以PLKO.1‐SRSF6‐shRNA为例：1.A体系PSPAX2、PMD2.G和PLKO.1‐SRSF6‐shRNA三种质粒质量均取2ug，溶于300ulDMEM中混匀；2.B体系18ulLipo2000转染试剂溶于300ulDMEM中混匀；3.将B体系加到A体系中混匀。静置10min；4.将步骤3中的混合物加到已更换3ml新鲜含10％胎牛血清DMEM培养基的6cm培养皿HEK293T细胞中；5.18h后将培养皿中液体换成5ml含10％胎牛血清DMEM培养基；6.36h后将培养皿中含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA的慢病毒培养液收集，0.45um滤器过滤，分装，‐80度冻存。这样就得到了含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA的慢病毒培养液。本发明将含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble的慢病毒的培养液感染结直肠癌肿瘤细胞，获得稳转细胞系；具体步骤以HT29细胞为例：1.将HT29细胞培养于六孔板中，每孔10^6个细胞，三个孔；2.第二天将六孔板中的前两个孔的培养基弃去，分别换成含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble的慢病毒的培养液；同时加polybreen使其终浓度为10ugml；3.第三天将培养板中细胞的培养液都换成2ml新鲜的含10％胎牛血清的1640培养基，同时加嘌呤霉素使其终浓度为4ugml；4.后每天观察，大约2‐3天后没有转染慢病毒的空白HT29细胞全部死亡；成功转染PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble慢病毒的两组细胞大部分存活下来。5.用WesternBlot的方法验证PLKO.1‐SRSF6‐shRNA的干扰效果，发现转染SRSF6‐shRNA的HT29细胞的SRSF6的表达水平明显低于阴性对照scramble组；稳定干扰掉SRSF6的肠癌细胞系构建成功。本发明通过CCK8细胞增殖实验和Transwell小室细胞迁移侵袭实验，检测了转染SRSF6‐shRNA的结直肠癌细胞组与阴性对照scramble的结直肠癌细胞组的增殖能力和迁移侵袭能力的差异。结果显示SRSF6干扰沉默后，结直肠癌肿瘤细胞的增殖能力和迁移侵袭能力相比于阴性对照组都明显下降。附图说明图1以本专利中的SRSF6‐shRNA的干扰序列，通过PLKO.1慢病毒包装系统，包装出的慢病毒感染结直肠癌细胞系SW620，HT29，HCT116后，WesternBlot实验验证得出SRSF6‐shRNA干扰效果显著；本专利中的SRSF6‐shRNA干扰序列能明显将结直肠癌细胞系中SRSF6表达沉默下来。其中scramble组作为阴性对照，SRSF6‐shRNA组代表本专利所提及的干扰RNA序列的实验组。图2以本专利中SRSF6‐shRNA将SRSF6沉默掉以后，结直肠癌细胞系SW620，HT29，HCT116增殖能力明显下降；本结果是通过CCK8实验得到。图3以本专利中SRSF6‐shRNA将SRSF6沉默掉以后，结直肠癌细胞系SW620，HCT116的迁移侵袭能力受到明显抑制；该结果通过Transwell实验来完成；照片右面的柱状图是用33％的醋酸溶解小室底部细胞吸收结晶紫后，检测吸光度值得到。实施例1SRSFR6‐shRNA干扰载体的构建及验证材料和方法1、材料结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCT116和慢病毒包装细胞系HEK293T由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供；RPMI1640、DMEM、0.05％Trypsin，购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。SRSF6抗体购自SIGMA公司；ACTIN抗体购自CST；Lipo2000转染试剂、嘌呤霉素购自Invitrogen；AgeI、EcoRI核酸内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa。大肠杆菌DH5α，PLKO.1、psPAX2、pMD2.G载体均由本实验室保存；引物委托上海桑尼有限公司合成；质粒提取试剂盒购于QIGEN公司；其他药品为国产分析纯。2、方法2.1、shRNA序列的设计根据PublicTRCPortal数据库，真对人SRSF6基因设计出的一条shRNA。shRNA的正反义寡核苷酸序列如下F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'本发明shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止采用T5结构。正义链的5’端添加了CCGG，与AgeI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5′端添加了AATTCAAAAA，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。阴性对照选取系统自动匹配的scramble序列。将干扰RNA的序列送上海桑尼公司合成出对应的DNA片段。2.2、PLKO.1‐SRSF6‐shRNA载体的构建及沉默效果检测1干扰载体的构建a取等量100mmolL的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液中加热到95度5分钟，缓慢降至室温，得到插入片段。b到AgeI、EcoRI双酶切PLKO.1表达载体3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体骨架，T4连接酶将插入片段和载体骨架连接。c连接体系转入大肠杆菌DH5α。d挑取阳性克隆进行培养并提取质粒，送上海桑尼测序鉴定。留存菌种冻存于‐80度。e将质粒鉴定成功菌种扩增培养100ml，大抽提质粒。就得到了大量的干扰片段表达载体。2重组慢病毒PLKO.1‐SRSF6‐shRNA的包装a第一天，HEK293T细胞培养于6cm培养皿中，24h后达到60％‐80％融合时进行转染。b第二天，表达质粒PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PMD2.G、PSPAX2共转HEK293细胞：一，将培养于6cm培养皿的HEK293细胞培养基换成新鲜的含10％胎牛血清DMEM培养基；二，配制A体系PSPAX2、PMD2.G和PLKO.1‐SRSF6‐shRNA三种质粒质量均取2ug，溶于300ulDMEM中混匀；配制B体系18ullipoD293T转染试剂溶于300ulDMEM中混匀；三，将B体系加到A体系中混匀，静置10min后均匀加到6cm培养皿HEK293细胞中，轻轻摇匀，放入培养箱。c第三天，转染18h后将培养皿中液体换成5ml含10％胎牛血清DMEM培养基。d第四天，换液后36h后将培养皿中培养液收集，0.45um滤器过滤，分装，‐80度冻存。于是得到了含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA重组慢病毒的培养液。3重组慢病毒PLKO.1‐SRSF6‐shRNA沉默效果验证和SRSF6‐shRNA稳转细胞系构建，以SW620细胞系为例。a第一天，将SW620细胞培养于六孔板中，每孔1*10^6个细胞，三个孔。b第二天，将六孔板中的前两个孔的培养基弃去，分别换成含有PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble的慢病毒的培养液。同时加polybreen使其终浓度为10ugml。c第三天，将培养板中细胞的培养液都换成2ml新鲜的含10％胎牛血清的1640培养基，同时加嘌呤霉素使其终浓度为4ugml。d第四天以后，加嘌呤霉素大约2‐3天后没有转染慢病毒的空白SW620细胞全部死亡。成功转染慢病毒PLKO.1‐SRSF6‐shRNA、PLKO.1‐scramble的两组细胞大部分存活下来。这样就得到了SRSF6‐shRNA和阴性对照scramble的稳转细胞组。e将六孔板中存活下来的细胞用蛋白裂解液消化，WesternBlot验证的到SRSF6‐shRNA细胞组的SRSF6表达明显低于阴性对照scramble细胞组的表达量，详见图1。实施例2SRSFR6‐shRNA对结直肠癌细胞增殖能力的抑制材料和方法1、材料结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCT116由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供。RPMI1640、DMEM、0.05％Trypsin，CCK8试剂购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。嘌呤霉素购自Invitrogen。其他药品为国产分析纯。2、方法2.1将筛选好的稳转细胞系以SW620为例，分别计数5*10^5个铺于六孔板两个孔,此时培养基已经无嘌呤霉素2.2约两天后，铺96孔板，进行CCK8增殖实验。1将SW620‐SRSF6‐shRNA组和SW620‐scramble组细胞用胰蛋白酶消化下来，收集细胞，计数，使其细胞终浓度为每100ul含10％胎牛血清1640培养基含2000个细胞，总量为3ml；2将两组细胞终浓度稀释为每100ul含10％胎牛血清1640培养基含2000个细胞的培养基，加到96孔板中，每组12个小孔0h，24h，48h，72h共4个时间点，每个时间点需3个复孔，所以需12个小孔，每个小孔100ul培养基，含2000个细胞。同时向96孔板中加12个小孔不含细胞的10％胎牛血清的1640培养基作为空白对照BLK。其余空下的孔加上约100ulPBS，防止培养基蒸发。33h后，细胞贴壁，向SW620‐SRSF6‐shRNA组和SW620‐scramble组及BLK组加CCK8试剂，每一组加3个小孔，每个小孔加10ul。4加CCK8试剂3h后，将所有加药的孔按顺序一一对应转移到一张新的96孔板中，在酶标仪上选择检测CCK8的波长，进行吸光度检测。此时，为0h数据。50h为基点，后续进行24h，48h，72h的检测试验。操作过程与0h操作相同。6数据处理，每个时间点实验组3个复孔的OD减去BLK组三个复孔OD值的均值，即为实验组3个复孔的绝对OD值。然后再根据每个时间点的两组细胞的3个复孔的绝对OD值，得到了增殖曲线，见图2。实施例3SRSFR6‐shRNA对结直肠癌细胞迁移侵袭能力的抑制材料和方法1、材料结直肠癌细胞系SW620、HT29、HCT116由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供。RPMI1640、DMEM、0.05％Trypsin，试剂购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。嘌呤霉素购自Invitrogen。Transwell双层板购于COSTAR公司，Matrigel胶购于BD公司，结晶紫购于碧云天公司。其他药品为国产分析纯。2、方法2.1将筛选好的稳转细胞系以SW620为例，分别计数5*10^5个铺于六孔板两个孔,此时培养基已经无嘌呤霉素。2.2约两天后，铺Transwell小室。1将含有50ugul的FN均匀涂在小室底部涂10ul。于生物安全柜内等其风干侵袭实验要加Matrigel,原液用无血清1640稀释50倍，每小孔加50ul，置于细胞培养箱1h，待Matrigel凝固，余下培养基析出后，将其吸除。2将SW620‐SRSF6‐shRNA组和SW620‐scramble组细胞用胰蛋白酶消化下来，收集细胞，计数，使其细胞终浓度为1*10^6个每100ul无血清1640培养基，总量为400ul。3向容纳小室的下层24孔板内每孔加500ul含10％胎牛血清1640培养基。上层小室内加100ul含1*10^6个细胞的无血清培养基。SRSF6‐shRNA组和scramble组每组设置三个复孔。4约1‐2天后，将SRSF6‐shRNA组和scramble组小室同时取出取出，吸掉室内培养基擦除室内细胞，用600ul4％多聚甲醛固定15分钟；结晶紫染色10分钟；PBS洗三次，晾干后。显微镜下拍照。得到图3左侧照片。5350ul含有33％的醋酸溶解下小室内部细胞吸收的结晶紫，然后吸出100ul到96孔板中，SRSF6‐shRNA组和scramble组，每组三个复孔；另外有100ul的33％的醋酸三个复孔，作为空白对照。测吸光度，计算出绝对吸光度。得到图3右侧柱状图。SEQUENCELISTING110浙江大学120一种靶向SRSF6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用13021602170PatentInversion3.3210121158212DNA213sHRNA序列4001CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG58210221158212DNA213sHRNA序列4001AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG58

权利要求：1.一种慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有人的SRSF6的基因干扰片段,其特征是该载体为PLKO.1‐SRSF6‐shRNA,该载体中包含的shRNA序列是F:5'‐CCGGCGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACGTTTTTG‐3'R:5'‐AATTCAAAAACGTACAGAATACAGGCTTATTCTCGAGAATAAGCCTGTATTCTGTACG‐3'；所述的载体构建方法如下：合成上述shRNA序列对应的DNA寡核苷酸序列，a取等量100mmolL的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液中加热到95℃，5分钟，缓慢降至室温，得到插入片段；b用AgeI、EcoRI双酶切PLKO.1表达载体3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体骨架，T4连接酶将插入片段和载体骨架连接。2.权利要求1所述的慢病毒质粒载体在制备治疗结直肠癌药物中的用途。

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