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申请/专利权人：陈雪玲

摘要：本发明公开了一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，该方法通过建立细粒棘球蚴感染小鼠模型以及体外原头蚴与巨噬细胞共培养体系，检测巨噬细胞PPARs的表达水平及其对巨噬细胞极化的调节，并在此基础上抑制PPARs通路，进一步探讨PPARs对巨噬细胞极化的影响，及在包虫病免疫逃逸过程中的作用。

主权项：一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.体外实验1.1RAW264.7细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节用RAW264.7细胞与原头蚴共培养，在12、24、36、48、72h分别收取细胞和上清，用qRT‑PCR的方法检测PPAR‑γ、PPAR‑α以及巨噬细胞M1型相关因子TNF‑α、MCP‑1、IL‑1β，M2型巨噬细胞相关因子Arg‑1、TGF‑β、Fizz‑1的mRNA水平；ELISA方法检测MR和Arg‑1的蛋白表达水平；1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节；1.3小鼠腹腔巨噬细胞与原头蚴共培养，阻断PPARs通路，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节实验组提前用PPARγα抑制剂处理腹腔巨噬细胞2小时，对照组加等量PBS，然后再与原头蚴共培养，48h收取细胞，重复上述实验；步骤2.体内试验2.1建立原头蚴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节；2.2建立原头蚴感染小鼠动物模型，阻断PPARs通路检测其对巨噬细胞极化的调节在建立动物感染模型前实验组用PPARγα抑制剂处理小鼠，对照组用等量PBS处理，24h后再建模，15天时处死小鼠收集细胞，重复上述实验。

全文数据：一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法。背景技术[0002]包虫病（Hydatiddisease又称棘球蝴病，是棘球蝴绦虫（Echinococcusgranulosus的幼虫在人畜体内寄生，产生的一种人畜共患的慢性感染性疾病，也是地方性感染性疾病，在牧区高发。常见的有囊型包虫病Cysticechin〇C〇CC〇Sis，CE和泡型包虫病Alveolarechinococcosis,AE两种，分别是由细粒棘球蝴和多房棘球蝴幼虫寄生在人畜体内而感染的；在我国常见的是由细粒棘球蝴绦虫引起的囊型包虫病（Cysticechinococcosis,CE。这对公共卫生和经济造成重大影响。[0003]包虫病全球分布广泛，常见于非洲、南美、欧亚大陆和中国北部等，在我国主要分布于较贫困边远的农牧区如新疆、西藏、内蒙古、四川、青海和黑龙江等地，其中新疆较为高发。该病属于自然疫源性疾病，也是人畜共患病，主要在动物与人之间以及动物与动物之间相互感染传播形成循环。人和牛、羊、马等食草类动物为中间宿主，可经口误食犬科类动物排出的含虫卵的粪便而感染，近几年经流行病学调查证实棘球蝴病疫区呈逐年扩大趋势，即由西北部开始向东南部发展，由牧区向非牧区扩散。每年都会有近四十万的人饱受该病的困扰和几千万人受到威胁，每年对畜牧业造成的经济损失高达十几亿。由于包虫病对人类身体健康危害严重，同样对畜牧业的发展造成极大威胁，在世界范围内被认为是严重危害公共卫生、环境安全与经济发展的问题。因此有控制传染源，切断传播途径，有效的预防包虫病成为一个至关重要的问题。[0004]包虫幼虫通过人体组织屏障和抵抗宿主早期炎性反应及免疫反应，侵入宿主组织后生长缓慢，往往数年才出现症状。主要寄生在肝、肾和肠系膜等部位，以机械性损害为主，受累部位常表现为轻微的疼痛和脏器功能障碍，也可表现为过敏反应和毒性反应，严重时甚至可能因过敏性休克致死。目前包虫病的治疗有外科手术和药物治疗。临床上一般首先采取手术治疗，其次为药物治疗，这样可以有效地提高治愈率，减少复发率，然而包虫病的包囊较脆弱易破裂，在手术过程中可能导致其损坏意外破裂，包囊中的部分原头蝴可能进入机体各个部位，造成严重的二次感染，这一过程大大提高了包虫病治疗难度。目前，对包虫病的致病机制仍不清楚，尚无有效的早期诊断方法，预防效果不明显。因此，研究包虫病的感染机制，尤其是早期虫体如何逃避宿主的免疫杀伤作用显得尤为重要，这对包虫病的预防治疗非常重要。[0005]细粒棘球蝴感染宿主后引起机体的免疫应答机制十分复杂，在人体免疫力正常的时候可能持续几年甚至几十年都无症状，呈潜伏生长转移，造成持续而严重的慢性损害。免疫保护和免疫损伤并存是主要免疫表现，而包虫能在宿主体内存活主要依赖于有效的免疫逃逸机制，棘球蝴感染早期可改变宿主的免疫反映形式:Thl细胞免疫向Th2细胞转换，从而起到逃避宿主免疫杀伤的作用。[0006]过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisomeproIiferator-activatedreceptors,PPARs，是一种致密分子构成的类固醇受体，属于由配体激活的Π型核受体超家族成员。分为三个亚型即α、β和Y。不同的亚型其表达部位及发挥的作用也不尽相同。[0007]PPAR-α主要在人和鼠的免疫细胞上表达，包括巨噬细胞、淋巴细胞以及树突状细胞，以及肝、肾、褐色脂肪组织BAT，在脂肪酸氧化、应激、炎症反应以及肝脏的纤维化中起重要。PPAR-γ主要在脂肪组织、肝、肾、单核巨噬细胞、平滑肌细胞等表面表达。有研究显示，PPAR-γ的功能复杂多样，它参与抗炎反应，调节糖脂代谢，诱导肿瘤细胞的凋亡和分化，抑制肿瘤血管生成，抗动脉粥样硬化，改善心功能和参与心室重构等。[0008]PPARs，作为核受体超家族的一员，1990年由Issemann等发现。自1990年Issemann报道了此类能被过氧化物酶体增殖物如贝特类降脂药、塑料成型剂、邻苯二甲酸醋及除草剂等激活的核内受体以来，已有三种PPARs亚型被分离鉴定，这3种亚型在结构及功能上均有差异。近年来，众多研究显示PPARs与许多疾病形成密切相关。[0009]以脂类代谢为例，PPARs在炎症反应中发挥重要作用。在成熟的巨噬细胞中，PPAR-γ配体罗格列酮在转录水平上抑制单核细胞趋化蛋白（MCP-I的表达，它是AS炎症过程启动的重要因子之一。PPAR-γ-LXR信号通路通过调节ABCA1G1转运体来巨噬细胞内胆固醇外流，Ozsa等发现]吡格列酮有抗动脉粥样硬化的作用，其机制可通是过增加某些基因的表达，增强巨噬细胞中胆固醇的外流，有效缓解动脉粥样硬化。此外，PPAR-α和PPAR-γ激活剂均可通过降低NF-kB活性，在转录水平抑制炎症因子如了册-€1、11^1|3、11^6和1冊3等表达。另外在肥胖的研究中发现脂肪组织巨噬细胞的活化可能与慢性炎症和免疫异常密切相关。[0010]巨噬细胞来自血液中的单核细胞，是由骨髓中的粒系-单系祖细胞分化而成，分布于机体的各个组织中，在不同的部位名称不同，如在脑组织中称小胶质细胞microglialcells，在肝中称为库佛细胞Kupffercells，KC，在肺中称为肺泡巨噬细胞alveolarmacrophage等。巨·细胞是一类具有异质性的免疫细胞，能吞杀伤病原体，清除损伤和衰老的细胞，是机体非特异性免疫的重要组成部分。巨噬细胞是存在于机体组织中的具有功能可变和表型可变的异构细胞，对特定的微环境信号能产生功能适应，参与不同的免疫反应。不同微环境对巨噬细胞的刺激可使其产生不同功能的细胞亚型，Thl型细胞因子如LPS可以促使巨噬细胞向Ml型极化，相反Th2型细胞因子如IL-4可以促使巨噬细胞向M2型极化。Ml型和促炎相关，而M2型和抗炎相关。与Ml型巨噬细胞相关的因子有TNF-a、IL-li3、IL-6、iN0S、和MCP-I等，与M2型相关的细胞因子有IL-HKMR甘露糖受体）、Arg-l、TGF-0和Fizz-I等。巨噬细胞在不同环境下的极化受不同因素的调节，核因子κΒNF-κ©通路，信号传导与转录激活因子（STAT通路，PPARs通路等转录因子在其中发挥关键的作用，其中PPARs通路对M2型巨噬细胞的极化起重要调节作用，PPAR-γ可通过抑制性蛋白IkB来抑制NF-kB、以及其他炎症因子在转录水平的表达来抑制炎症。巨噬细胞在不同微环境表型的可变性在很多疾病的发生发展过程中发挥重要的作用，巨噬细胞在炎症的产生发展和恢复过程中起重要的作用，这主要依赖于其对不同微环境的极化表型不同。[0011]在包虫病的研究过程中发现宿主感染细粒棘球蝴早期可出现明显的细胞炎性反应。Meeusne等曾报道绵羊感染包虫病后3-5d即可出现中性粒细胞和巨噬细胞浸润，感染三到四周后可见白细胞增多，且主要是巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞水平升高。[0012]根据前期实验我们猜测巨噬细胞可能在免疫逃逸中起重要作用，但具体是何种原因导致包虫病时这些因子表达的改变，仍然了解甚少。而PPARs与包虫病的关系及其表达水平，目前国内外尚未报道。发明内容[0013]本发明的目的在于提供一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法。通过建立细粒棘球蝴感染小鼠模型以及体外原头蝴与巨噬细胞共培养体系，检测巨噬细胞PPARs的表达水平及其对巨噬细胞极化的调节，并在此基础上抑制PPARs通路，进一步探讨PPARs对巨噬细胞极化的影响，及在包虫病免疫逃逸过程中的作用。[0014]其具体技术方案为:一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，包括以下步骤：[0015]步骤1.体外实验[0016]1.1RAW264.7细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节[0017]用RAW264.7细胞与原头蝴共培养，在12、24、36、48、7211分别收取细胞和上清，用qRT-PCR的方法检测PPAR-γ、PPAR-α以及巨噬细胞M1型相关因子TNF-α、MCP-1、IL-1β，M2型巨噬细胞相关因子六找-1、了6?-|3匕2-1的1111?祖水平$1^134方法检测1©和4作-1的蛋白表达水平。[0018]1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节；[0019]1.3小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，阻断PPARs通路，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节[0020]实验组提前用PPARya抑制剂处理腹腔巨噬细胞2小时，对照组加等量I3BS，然后再与原头蝴共培养，48h收取细胞，重复上述实验。[0021]步骤2.体内试验[0022]2.1建立原头蝴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调-K-T；[0023]2.2建立原头蝴感染小鼠动物模型，阻断PPARs通路检测其对巨噬细胞极化的调节[0024]在建立动物感染模型前实验组用PPARγa抑制剂处理小鼠，对照组用等量TOS处理，24h后再建模，15天时处死小鼠收集细胞，重复上述实验。[0025]进一步，步骤1中，1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节具体为：[0026]提取小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，在12、24、36、48h分别收取细胞，用qRT-?〇?的方法检测??六1?-丫、？?41?-€[以及巨噬细胞姐型相关因子了陬-€[、|«^-1、11^10，12型巨噬细胞相关因子Arg-l、TGF_0、Fizz-l的mRNA水平;WesternBlot方a、IkB、iNOS和Arg-I的蛋白表达水平。[0027]进一步，步骤2中，2.1建立原头蝴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节，具体为：[0028]建立原头蝴感染小鼠动物模型，BALBc小鼠随机分组，实验组腹腔接种原头蝴，对照组腹腔接种等量PBS;分别于第1、5、10、15天处死小鼠，收集血清和腹腔巨噬细胞。用91^-?〇?的方法检测??六1?-丫、？?六1?-€[以及巨噬细胞姐型相关因子了陬-€[、]\«^-1、几-10，]\12型巨噬细胞相关因子Arg-l、TGF_0、Fizz-l的mRNA水平;WesternBlot方法检测PPAR-γ、PPAR-α、ΙκΒ、iNOS和Arg-I的蛋白表达水平。ELISA方法检测MCP-I和Arg-I。[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果：[0030]本发明的研究结果表明：[0031]1.体外实验显示原头蝴促进巨噬细胞M2极化。[0032]1.1RAW264.7细胞与原头蝴共培养，PPARaγ和M2型相关因子Arg-1、TGF-KFizz-1的mRNA水平均逐渐升高，72h表达最高Ρ〈0.05;巨噬细胞Ml型相关因子TNF-a、MCP-l、IL-Ιβ的mRNA先升高后降低P〈0.05，Arg-l和MR的蛋白水平也逐渐增高。[0033]1.2腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，？?六1^丫和12型相关因子4找-1、了6?-|3丨以-1的mRNA水平均逐渐升高，48h表达最高P〈0.05;巨噬细胞Ml型相关因子TNF-a、MCP-l、IL-Ιβ先升高后降低P〈0.05。各因子蛋白水平和mRNA水平基本相一致。[0034]1.3加入PPARaγ抑制剂后，与未阻断前48h相比，PPARaγ和M2型相关因子Arg-1、TGFUizz-I的mRNA水平明显降低（Ρ〈0·05;M1型相关因子TNF-a、MCP-l、IL-10的mRNA水平明显升高P〈0.05。蛋白水平和mRNA水平相一致。[0035]2.体内实验显示原头蝴促进巨噬细胞M2极化。[0036]2.1建立小鼠细粒棘球蝴感染模型。腹腔巨噬细胞PPARaγ和M2型相关因子六找_1、TGF-0、Fizz-l的mRNA水平均逐渐升高，15天时表达最高P〈0.05;M1型相关因子TNF-a、MCP-I、IL-Ιβ先升高后降低P〈0.05。各因子蛋白水平和mRNA水平基本相一致。[0037]2.2阻断PPARs后，与未阻断前15天相比，PPARaγ和M2型相关因子Arg-I、TGF-0、FiZZ-1的mRNA水平明显降低P〈0.05;Ml型相关因子TNF-a、MCP-1、IL-1β的mRNA水平明显升高P〈0.05。蛋白水平和mRNA水平相一致。[0038]体内外实验均证明原头蝴感染小鼠早期，PPARaγ的表达逐渐升高，促进巨噬细胞由Ml型向M2型极化，从而在虫体免疫逃逸中发挥一定作用。[0039]本发明建立包虫病小鼠动物模型，从体内实验和体外实验两方面检测PPARs的表达，以及巨噬细胞Ml和M2型相关细胞因子的表达，从而阐明包虫病早期感染过程中PPARs在其中可能的机制，在此基础上，我们将使用PPARs抑制剂试图改变巨噬细胞的活化状态，有效杀伤虫体，这为棘球蝴病防治和新技术开发具有非常重要的意义。附图说明[0040]图IA为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测PPAR-γ的含量；[0041]图IB为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测PPAR-a的含量（*Ρ〈0.05；[0042]图2Α为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测TNF-a的含量；[0043]图2B为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测MCP-I的含量；[0044]图2C为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测IL-I邱勺含量*P〈0.05;[0045]图3A为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测Fizz-I的含量；[0046]图3B为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测TGFj的含量；[0047]图3C为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，qRT-PCR技术检测Arg-I的含量；[0048]图3D为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，ELISA技术检测Arg-I的含量；[0049]图3E为原头蝴与RAW264.7细胞共培养，ELISA技术检测MR的含量*P〈0.05;[0050]图4A为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测PPAR-γ的含量；[0051]图4Β为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测PPAR-α的含量；[0052]图4C为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测PPAR-γ的含量；[0053]图4D为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测PPAR-a的含量；[0054]图4E为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测IkB的含量（*P〈0.05；[0055]图5A为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测TNF-a的含量；[0056]图5B为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测TGFj的含量；[0057]图5C为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测IL-W的含量；[0058]图为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测Fizz-I的含量；[0059]图5E为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测MCP-I的含量；[0060]图5F为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测Arg-I的含量；[0061]图5G为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测iNOS的含量；[0062]图5H为腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测Arg-I的含量*P〈0.05；[0063]图6A为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测PPAR-γ和PPAR-a的表达；[0064]图6B为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测PPAR-γ的表达；[0065]图6C为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测PPAR-a的表达；[0066]图6D为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测IkB的表达；[0067]图7A为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测MCP-I和IL-Ιβ的表达；[0068]图7B为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测TNF-a的表达；[0069]图7C为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测TGF-β和Arg-I的表达；[0070]图7D为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，qRT-PCR技术检测Fizz-I的表达；[0071]图7E为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测iNOS的表达；[0072]图7F为加入GW9662PPAR-γ抑制剂或MK-886PPAR-a抑制剂），腹腔巨噬细胞和原头蝴共培养，WesternBlot技术检测Arg-I的表达；[0073]图8A为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测PPAR-γ的表达；[0074]图8Β为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测PPAR-a的表达；[0075]图8C为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，WesternBlot检测PPAR-γ的表达；[0076]图8D为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，WesternBlot检测PPAR-α的表达；[0077]图8E为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，WesternBlot检测IκΒ的表达；[0078]图9A为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测TNF-a的表达；[0079]图9B为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测TGF-β的表达；[0080]图9C为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测IL-1β的表达；[0081]图9D为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测Fizz-I的表达；[0082]图9E为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测MCP-1的表达；[0083]图9F为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，qRT-PCR检测Arg-1的表达；[0084]图9G为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，ELISA检测MCP-I的表达；[0085]图9H为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，ELISA检测Arg-I的表达；[0086]图91为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，WesternBlot检测iNOS的表达；[0087]图9J为原头蝴感染小鼠，在不同时间点收集小鼠腹腔巨噬细胞，WesternBlot检测Arg-I的表达；[0088]图IOA为抑制PPAR-γPPAR-a，qRT_PCR检测感染小鼠腹腔巨噬细胞PPAR-γ和PPAR-a的表达；[0089]图IOB为抑制PPAR-γPPAR-a,WesternBlot检测感染小鼠腹腔巨噬细胞PPAR-γ的表达；[0090]图IOC为抑制PPAR-γPPAR-a,WesternBlot检测感染小鼠腹腔巨噬细胞PPAR-a的表达；[0091]图IOD为抑制PPAR-γPPAR-a,WesternBlot检测感染小鼠腹腔巨噬细胞Ikb的表达；[0092]图IlA为抑制PPAR-γPPAR-a，qRT-PCR检测感染小鼠腹腔巨噬细胞MCP-I和IL-Ιβ的表达；[0093]图IlB为抑制PPAR-γPPAR-a，qRT_PCR检测感染小鼠腹腔巨噬细胞TNF-a的表达；[0094]图IIC为抑制PPAR-γPPAR-a，qRT-PCR检测感染小鼠腹腔巨噬细胞TGF-^PArg-I的表达；[0095]图IlD为抑制PPAR-yPPAR-a，qRT_PCR检测感染小鼠腹腔巨噬细胞Fizz-I的表达；[0096]图1把为抑制??六1?-丫^^41?-€[，评68七6«181^检测感染小鼠腹腔巨噬细胞丨冊3的表达；[0097]图IlF为抑制PPAR-γPPAR_a，WesternBlot检测感染小鼠腹腔巨噬细胞Arg-I的表达。具体实施方式[0098]下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。[0099]实施例1:RAW264.7细胞与细粒棘球蝴共培养早期PPARs的变化及其对巨噬细胞极化的调节目的:本研究通过建立RAW264.7与棘球蝴共培养模型，探索棘球蝴感染RAW264.7细胞后PPARs的表达水平，及巨噬细胞Ml型和M2型相关因子的表达水平，从而阐明包虫病感染早期PPARs的非特异性免疫调节作用。为进一步探索其在棘球蝴逃避宿主的免疫应答所起的作用奠定基础。[0100]1材料[0101]1.1主要仪器和试剂[0104][0105]1.2主要细胞及病原体采集来源[0106]细胞:小鼠巨噬细胞株RAW264.7为实验室保种存放。[0107]原头蝴:感染细粒棘球蝴的绵羊病肝来自新疆昌吉市屠宰场。[0108]2方法[0109]2.1原头蝴的制备[0110]2.1.1细粒棘球蝴原头蝴的采集[0111]从昌吉屠宰场购买感染细粒棘球蝴病的羊肝，酒精消毒，清洗。选取无钙化的、无感染的、体积较大的囊泡完整的单囊型包囊内容物囊液清澈），置于无菌容器中，待原头节（Pr〇t〇SC〇le，PSC自然沉淀，用含1%双抗（100Uml青霉素和链霉素）的无菌PBSPH7.3清洗3次，去除活性较差的原头蝴以及育囊碎片，用含双抗的PBS重悬头节。[0112]2.1.2细粒棘球蝴原头蝴的培养[0113]配制培养基：10%胎牛血清的RPMI1640培养液青霉素100IUmL，链霉素100IUmL，将取出的头节按一定浓度放入培养瓶中加入培养基，放入培养箱中培养（37Γ5%CO2，定期观察生长情况，根据实际情况进行换液。[0114]2.1.3鉴定细粒棘球蝴原头蝴的活性[0115]将培养的原头蝴取出一部分，用I3BS冲洗几遍，然后加入适量的I3BS,吹打混匀，抽取IOyL左右置于载玻片上，用0.5%的伊红染液染色5min，然后轻轻盖上盖玻片，切忌用力挤压，迅速的在倒置显微镜下观察头节颜色变化，计数时间越短越好。活性好的头节不染色，活性差或死头节身体易着色呈红色，分别计数活原头蝴和死原头蝴的总数，活性大于90%以上即可用于实验。[0116]2.2建立原头蝴与RAW264.7细胞株体外感染模型[0117]将培养至对数期的RAW264.7细胞接种于6孔板内，细胞浓度为每孔IX106ml，待细胞贴壁后进行下列操作。感染组:每孔细胞加入浓度为1000个ml原头蝴Iml共培养;对照组：1ml10%FBSDMEM与Iml细胞共培养，各个时间点均设三个复孔，在37°C5%C02培养箱内培养，分别在培养12h、24h、36h、48h和72h后，收集各组细胞，用于qRT-PCR检测。收集各时间点上清，短暂离心，冻存于_80°C，用于ELISA检测。[0118]2.3试剂盒法提取原头蝴与RAW264.7细胞共培养后细胞株总RNA[0119]按照试剂盒说明书进行以下操作：[0120]1、根据细胞量向处理过的培养板中每孔加入ImlRZ细胞裂解液，用加样器反复吹打至液体透明，取新的无RNA酶的EP管，将液体转移至此管，做好标记，封口膜密封，立即提取RNA或-80°C保存备用；[0121]2、将收获的细胞裂解液的EP管放置室温5min，使得核酸蛋白复合物完全分离，加入200μ1氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。[0122]3、4°C离心12,000rpmmin，IOmin;离心后样品会分为三层，黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA—般在水相中，体积约为所加RZ裂解液的50%。小心吸取水相至新无RNA酶EP管中，进行下步。[0123]4、将0·5倍无水乙醇缓慢加入EP管中，混匀，将所有溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4°C离心12,000rpmmin，30sec，弃去收集管中废液；[0124]5、向吸附柱CR3中加入0.5ml去蛋白液RD使用前请先检查是否加入无水乙醇），4°C离心12，000rpmmin，3〇sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；[0125]6、向吸附柱中加入0.5ml漂洗液RW使用前请先检查是否加入无水乙醇），室温静置2min，4°C12，000rpmmin，30sec，弃废液；[0126]7、重复步骤6;[0127]8、将吸附柱放入新的收集管中，4°C12，OOOrpmmin离心2min，离心后将吸附柱室温放置数分钟，去除残余的液体。注意:该步目的是去除吸附柱中残余液体，离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如有漂洗液残留可能会影响后续实验。[0128]9、将吸附柱转入新EP管中，加入30-100μ1RNase-FreeddH20,室温放置2min，4°C12，000rpmmin离心2min，使RNA充分溶解[0129]10、取适量RNA用核酸定量仪Nanodrop2000检测其浓度和纯度。[0130]11、其余RNA样品可立即进行逆转录或保存于-80°C备用。[0131]2.4RNA逆转录合成cDNA[0132]将提取的各组RNA调成同一浓度后按试剂说明书进行操作：[0133]1、冰浴下将下列试剂加到新的无核酸酶的EP管中，[0134][0135]2、70°C加热5min后在冰上迅速冷却2min。简短离心后加入以下试剂[0136][0137]3、将上述反应体系充分混匀，42°C温浴50min;[0138]4、95°C加热5min，终止反应后，用Rnase-FreeCldH2O将反应体系稀释到50μ1;[0139]直接用于qRT-PCR扩增反应或冷冻至-80°C保存，备用。[0140]2.5引物设计与合成[0141]根据Genbank中小鼠PPAR-γ，PPAR-a，TNF-a，MCP-l，IL-10，Arg-l，TGF-0，Fizz-I及内参β-actin的相应基因序列，应用Primer5软件进行分析和比较，选取适当的区域合成引物，并由上海生工公司合成，引物序列见表1。[0142]表IRT-PCR引物[0143][0144]2·6进行实时荧光定量PCRqRT-PCR检测[0145]严格按照说明书操作，用SYBRGreen两步法检测相关细胞因子的表达水平：[0146]UqRT-PCR反应体系：[0147][0148]2、qRT_PCR反应条件：[0149][0150]将96孔板短暂离心后，放入Bio-RadPCR仪中，设置反应条件，开始运行程序。运行结束后导出结果进行分析，计算采用相对定量即2_ΔΔα，ΔΔCt=ΔCt^s組-Δ△Ct=Ct翻麵[0151]2.7ELISA法检测相关细胞因子的表达水平[0152]按照试剂盒相关说明书进行操作[0153]2.7.1试剂准备[0154]1、实验前将所有的标本和试剂在室温平衡30min，切忌试剂不能直接在37°C溶解。[0155]2、稀释标准品：标准品一般均为冻干品，将ImL标准品稀释液加入标准品瓶中，室温静置约10分钟，颠倒混匀，使其浓度为50ngmL，作为贮存液。先将其稀释为10ngmL标准曲线最高浓度后，进行倍比稀释，共稀释7次，设置复孔。空白孔为标准品稀释液OngmL。为保证实验结果有效性，每次实验均应使用新的标准品溶液。[0156]3、检测溶液A及检测溶液B的配制[0157]4、配制洗涤液[0158]5、配制底物溶液[0159]2.7.2操作过程[0160]1、加样:分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入IOOyL不同浓度的标准品（试剂准备2。空白孔加IOOyL试剂准备第二步），余孔加待测样品100yL，酶标板加上覆膜，37°C温育2小时。每组均设三个复孔。[0161]2、弃去液体，甩干，不用洗涤。[0162]3、100yL每孔加检测溶液A工作液（已配制），酶标板盖上覆膜，37°C孵育1小时。[0163]4、扣去孔内液体，350μΐ7每孔加入洗涤液洗涤，停留1-2分钟，甩掉酶标板内的液体，酶标板朝下在吸水纸上用力拍几次，重复洗板3〜4次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全扣干。[0164]5、IOOyL每孔加入检测溶液B工作液，盖上覆膜，37°C孵育30分钟。[0165]6、甩去孔内液体，洗板5次，方法同步骤4。[0166]7、每孔加入90yL底物溶液，盖上覆膜，37°C避光显色反应时间一般控制在15-25分钟，不超30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。8、每孔加50yL终止溶液，终止反应，此时蓝色转为黄色。[0167]9、读板:当确认酶标板底部没有水滴以及孔内无气泡后，用酶标仪在450nm波长读取各孔的光密度0D值）。[0168]10、根据标准品的OD值和稀释浓度绘制标准曲线，并建立标准曲线方程式，再通过方程式计算出待测样品的浓度。[0169]2.8统计学分析[0170]用SPSS17.0统计学软件进行分析，组间的显著性差异采用one-wayANOVA检验，组内采用两样本均数t检验。[0171]3结果[0172]3.1细粒棘球蝴与RAW264.7细胞共培养，RAW264.7巨噬细胞PPAR-γ表达逐渐升高[0173]通过荧光定量PCR技术检测RAW264.7细胞PPAR-γ表达水平。结果显示:细粒棘球蝴与RAW264.7细胞共培养在12、24、36、48、72小时，巨噬细胞??六1?-丫表达逐渐升高屮〈0.05，见图1Α。[0174]3.2细粒棘球蝴与1^¥264.7细胞共培养，1^¥264.7巨噬细胞??41?-€[表达逐渐升高[0175]通过荧光定量PCR技术检测RAW264.7细胞PPAR-α表达水平。结果显示:细粒棘球蝴与1^胃264.7细胞共培养在12、24、36、48、72小时时，巨噬细胞？?41?-€[表达逐渐升高（?〈0.05，见图1B。[0176]3.3细粒棘球蝴与RAW264.7细胞共培养，RAW264.7细胞Ml型相关因子表达先升高后降低[0177]通过荧光定量PCR检测细粒棘球蝴感染早期，RAW264.7细胞Ml型相关细胞因子TNF-a、MCP-1、IL-1β表达水平。结果显示:共培养后TNF-a、MCP-1在12、24、36、48小时时表达逐渐升尚，48小时达最尚，以后逐渐降低P〈0.05;IL-10在36小时达最尚，以后逐渐降低P〈0.05，见图2。[0178]3.4细粒棘球蝴与1^1264.7细胞共培养，1^1264.7细胞12型相关因子1111?祖水平和蛋白水平表达均逐渐升高[0179]通过荧光定量PCR检测细粒棘球蝴感染早期，RAW264.7细胞M2型相关细胞因子Arg-I、TGFUizz-I表达水平，用ELISA方法检测Arg-I和MR的表达水平。结果显示:共培养后4作-1、了6?-0^22-1在12、24、36、48、72小时时表达逐渐升高，72小时达最高（?〈0.05，Arg-I和MR的ELISA结果也相同，见图3。[0180]实施例2:腹腔巨噬细胞与细粒棘球蝴原头蝴共培养早期PPARs的表达水平及其对巨噬细胞极化的调节[0181]目的：本研究是在前期细胞株基础上进一步研究原代细胞的作用，收集小鼠腹腔巨噬细胞，并与棘球蝴共培养建立模型，探索棘球蝴感染小鼠腹腔巨噬细胞后PPARs的表达水平，及巨噬细胞Ml型和M2型相关因子的表达水平，从而阐明包虫病感染早期PPARs的非特异性免疫调节作用。并在此基础上使用PPARs的抑制剂下调PPARs，进一步阐述其在棘球蝴逃避宿主的免疫应答中所起的作用。[0182]1材料[0183]1.1材料及试剂[0185]注:其他同实施例I[0186][0187][0188]注:其他试剂同实施例I[0189]1.2主要病原体采集及小鼠来源[0190]原头蝴:感染细粒棘球蝴的绵羊病肝来自新疆昌吉市屠宰场。[0191]小鼠：6-8周的雌性BALBc小鼠，体重20±2g。购自新疆医科大学动物实验中心。[0192]2方法[0193]2.1原头蝴的采集、培养、活性鉴定同实施例1[0194]2.2小鼠腹腔巨噬细胞的分离[0195]随机选取6-8周的雌性MLBc小鼠，体重20±2g，采用颈椎脱臼法处死小鼠，在75%的酒精中浸泡2分钟，取出沥干，在无菌操作台上将小鼠四肢固定在操作板上，用无菌器械剪开皮肤暴露覆膜，用5ml注射器抽取无血清1640培养基轻轻注射进腹腔，轻柔按摩腹部5分钟左右，从胸骨下方选择组织较少的地方，尽量避开肠粘膜等，回抽液体，将收集的腹腔灌洗液离心，1500rmin，弃上清，用配制好的培养基重悬，将细胞转移至六孔板中，37°C，5%CO2培养箱中培养过夜，弃上清，用PBS冲洗去除未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞，显微镜下观察为椭圆形或多角形。[0196]2.3建立细粒棘球蝴感染腹腔巨噬细胞模型[0197]2.3.1建立普通细粒棘球蝴与腹腔巨噬细胞共培养模型（同实施例1[0198]2.3.2PPAR-aPPAR_γ阻断后细粒棘球蝴与腹腔巨噬细胞共培养模型[0199]l.PPAR-γ阻断组：用GW9662以终浓度ΙΟμπιοΙL预处理细胞1小时；PPAR-a阻断组：用MK-886以终浓度lymolL预处理细胞1小时。对照组:加等量PBS。[0200]2.预处理后与原头蝴共培养方法同部分一。在48小时收取细胞。[0201]2.4试剂盒法提取腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养后总RNA侗实施例1[0202]2.5RNA逆转录成cDNA同实施例1[0203]2.6实时荧光定量PCR检测（同实施例1[0204]2.7免疫印迹〇^8七6«181〇〇检测？卩厶1?-丫、？?厶1?-〇、厶找-1、1冊5、1咄及0-。衍11的蛋白表达水平[0205]2·7·IWesternBlot试剂配制[0206][0207]注:磁力搅拌器上充分溶解后定容至1000ml，棕色玻璃瓶4°C保存[0208][0209]注:充分混匀，置于棕色瓶定容至1000ml,4°C保存[0210][0211]注:磁力搅拌器上充分混匀，置于瓶中定容至1000ml，室温保存[0212][0213]注:磁力搅拌器上充分混匀，定容至250ml，室温保存[0214][0215]注:磁力搅拌器上充分混匀，4°C保存[0216][0217]注:磁力搅拌器上混匀，现配现用（甲醇易挥发），提前预冷4°C避光保存[0220]注:磁力搅拌器充分混匀，玻璃瓶中室温保存[0218][0219][0221][0222]注:磁力搅拌器充分溶解，用ddH2〇定容至200mL，浓盐酸调节pH=6.8,过滤至玻璃瓶中，4°C保存[0223][0224]注:磁力搅拌器充分溶解用CldH2O定容至200mL浓盐酸调节pH=88过滤至玻璃瓶中4°C保存。[0225][0226]注:充分混匀后，避光4°C保存最好现配现用，放置时间不应超过一周）[0227][0228]注:摇床上充分混匀后使用，现配现用。[0229][0230]注:用CldH2O定容至IOOmL，37°C充分溶解，过滤至棕色玻璃瓶，于4°C冰箱保存。[0231]2.7.2聚丙烯酰胺凝胶配方[0234]2.7.3聚丙烯酰胺凝胶配制[0235]1用洗涤剂在自来水下清洗制胶玻璃板，使用柔软纱布轻轻擦拭灌胶面，确保无残余凝胶粘附，自来水冲洗干净后，再用单蒸水冲洗三遍，在烘干箱中烘干。[0236]2将洗好的玻璃插在制胶板上，根据蛋白分子量配制10%分离胶（配方见2.7.2，即下层胶，两块胶10ml，配制时要迅速，最后加TEMED后充分搅拌均匀，然后灌胶，用去离子水封闭液面，去除气泡并隔绝空气，室温静置40分钟。[0237]3待分离胶完全聚合后胶面与水面可见分离线），轻轻弃去上层水相，用吸水纸吸干水分。[0238]4浓缩胶配置（按2.7.2中配方配制），即上层叫，两块胶6ml，同样操作要快速，灌制顶部时要小心不要产生气泡，垂直插入10孔齿梳，室温静置30分钟。[0239]5待凝胶完全聚合后，取下胶板，浸泡于去离子水中4°C保存备用（凝胶放置时间最好不要超过一星期）。[0240]2.7.4腹腔巨噬细胞总蛋白提取[0241]1将2.3中处理的细胞弃去培养基，用预冷的I3BS清洗细胞2-3遍，务必吸净PBS残液，将培养板放在冰上，根据细胞量六孔板每孔加150此预冷的含有1.5yL苯甲基磺酰氟PMSF的细胞裂解液RIPAPMSF:RIPA=1:100，冰上放置15分钟。[0242]2用细胞刮轻轻的将细胞刮至培养皿一侧，将刮取的液体收集至1.5ml的EP管中，用360度旋转摇床在4°C，50rpm，旋转裂解40分钟。[0243]34°C离心机12000rmin离心10分钟，收集上清液至新的1.5mlEP管中，用BCA法蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，用上述裂解液配平所有样本。[0244]⑷每400μ1蛋白加入ΙΟΟμΙ的5Xproteinloadingbuffer上样缓冲液，BP蛋白：5Xproteinloadingbuffer=4:l，颠倒混勾后在蛋白加热模块上100°C煮沸8-10分钟，降至室温后分装放入-20°C冰箱保存，长期保存最好放入-80°C冰箱。[0245]2.7.5WesternBlot检测[0246]1电泳:将提前制好的凝胶取出，组装到电泳架上，至于电泳槽中，将提前配好的预冷电泳液倒入槽中，内槽外槽均需有电泳液，拔掉齿梳，将蛋白加入加样孔中，上样量为20yg孔，加入合适的彩虹蛋白Marker5μ1，将电泳槽放入水盆中，并加入冰块，以恒定电压80V电泳120分钟，当上样缓冲液指示剂达到凝胶最下缘时停止电泳，取出胶板。[0247]2将玻璃板掀开，根据蛋白Marker对凝胶进行合适位置的裁剪，切胶条左上角为标记，放入配好的IX电转液中浸泡。[0248]3根据胶条大小裁剪等大小的PVDF膜，并将其在甲醇中激活3分钟，同样切除左上角为标记，还要裁剪同样大小的厚滤纸，一并放入电转液中浸泡。[0249]4电转：按照滤纸—膜—胶—滤纸从下往上的顺序胶靠近负极，膜靠近正极），放入湿转电转膜仪中，切记一定要清除各层间的气泡，否则将影响转膜效果。[0250]5恒压80V，2小时（不同分子量需要时间各不相同）。转膜时最好放入冰袋，不可温度过高。[0251]6封闭：将转膜后的PVDF膜放入提前配好的5%的脱脂奶粉中进行封闭，在摇床上40rpm，室温封闭2小时，也可4°C封闭过夜。[0252]7孵育一抗：一抗按PPAR-γ1:1000，PPAR_a3ygmL，IkB1:1000，Arg-I1:5000，iN0Sl:1000，0-Actinl:5OOO的比例稀释于5%进口脱脂奶粉与1XTBSI1配制的封闭液中，50-60rpm，4°C孵育过夜。[0253]8洗涤：一抗孵育结束后，使用IXTBST快速震荡洗膜5次，第一次5分钟，4次10分钟。[0254]9孵育二抗：将辣根过氧化物酶（HRP标记的羊抗鼠（1:20000和羊抗兔（1:20000二抗分别和脱脂奶粉溶于IXTBST中，将相应的膜放入对应二抗中，摇床上40rpm常温孵育2小时。[0255]10洗涤:二抗结束后重新洗模4次，第一次5分钟，3次15分钟。[0256]11显色:洗涤结束后，将PVDF膜置于干净的玻璃板上，吸干水分，按照ECL发光试剂盒说明书将A液和B液按照比例混合，均匀滴加在膜上，使其与膜结合三分钟，用保鲜膜包好，避免产生气泡。[0257]12曝光:暗室中将剪好的胶片放在膜上，压片10s-60s不等根据条带强弱情况来决定压片时间，条带亮则减少压片时间），放入显影液中，在红外线下观察条带显影情况，条带合适时即可定影。定影完成后在清水中清洗，晾干胶片。[0258]13拍照:将胶片放入凝胶成像系统中进行拍照处理。[0259]2.8统计学分析同实施例1[0260]3结果[0261]3.1原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后不同时间点PPARs的表达水平及巨噬细胞相关因子的表达水平[0262]3.1.1原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后PPAR-γa的mRNA表达逐渐升高[0263]图4A和B分别为qRT-PCR检测PPAR-γa的表达水平，A图显示原头蝴和腹腔巨噬细胞共培养后，PPAR-γ表达逐渐升高，48小时表达最高;B图为PPAR-a表达水平，也是逐渐升高，48小时达最高，差异有统计学意义P〈0.05图4A-B。[0264]3.1.2原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后PPAR-γa和IkB的蛋白表达逐渐升高[0265]如图4C、D、E，用WesternBlot方式检测PPAR-γα和IkB的蛋白表达水平，结果显示:随着感染时间增加其表达量也逐渐增加，48小时表达最高，增加有统计学意义[0266]P〈〇·05〇[0267]3.1.3原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后Ml型巨噬细胞相关因子表达先升高后降低[0268]如图5,用qRT-PCR检测Ml型巨噬细胞相关因子TNF-α㈧，IL-Ιβ⑹，和MCP-IE的mRNA水平，结果显示，TNF-a在开始共培养到24、36小时表达均增高，48小时又降低；IL-Iβ在12小时表达增高，24、36、48小时表达逐渐降低；MCP-I表达趋势和IL-Ιβ相同。用WesternBlot的方式检测iNOS的蛋白表达水平，结果显示在24小时蛋白表达水平最高，后降低，差异有统计学意义P〈〇.05图5。[0269]3.1.4原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后M2型巨噬细胞相关因子表达逐渐升高[0270]如图5,用qRT-PCR检测M2型巨噬细胞相关因子TGF-βB,Fizz-I⑼和Arg-IF的mRNA水平，结果显示，TGF-β在开始共培养到24、36、48小时表达均逐渐增高，48小时表达最高;Fizz-I表达水平也是逐渐增高，48小时达最高;Arg-I表达趋势和TGF-β及Fizz-I相一致，48小时最高。用WesternBlot的方式检测Arg-I的蛋白表达水平，结果显示其蛋白水平和mRNA水平表达相一致均为逐渐增高，48小时表达最高，差异有统计学意义（P〈0.05图5。[0271]3.2加入抑制剂后PPARs的表达水平和巨噬细胞极化相关因子的表达水平[0272]3.2.1加入抑制剂后PPARγa的mRNA表达水平降低[0273]如图6A，加入GW9662PPAR-γ抑制剂）后48小时PPAR-γ的mRNA表达水平降低；加入MK-886PPAR-a后48小时PPAR-a的mRNA表达水平也降低，且差异有统计学意义（P〈0.05〇[0274]3.2.2加入抑制剂后PPARγa及IκΒ的蛋白表达水平逐渐降低[0275]如图6B、C、D显示，加入GW9662PPAR-γ抑制剂后48小时PPAR-γ的蛋白表达水平与未加抑制剂48小时相比降低，同时IkB的表达水平也降低;加入MK-886PPAR-a后48小时PPAR-a的蛋白表达水平与未加组48小时相比也降低，IκΒ的表达水平也降低，且差异有统计学意义P〈〇.〇5。[0276]3.2.3加入抑制剂后巨噬细胞Ml型相关细胞因子表达升高[0277]如图7,加入抑制剂后，原头蝴感染腹腔巨噬细胞48小时，MCP-UIL-Ιβ图A和TNF-a图B与未加抑制剂组48小时相比mRNA表达水平升高，iNOS图E的蛋白水平也升高，升高有统计学意义P〈〇.05。[0278]3.2.4加入抑制剂后巨噬细胞M2型相关细胞因子表达降低[0279]如图7,加入抑制剂后，原头蝴感染腹腔巨噬细胞48小时，TGF-KArg-I图C和Fizz-I图D与未加抑制剂组48小时相比mRNA表达水平降低，Arg-I的蛋白水平也降低，降低有统计学意义P〈〇.〇5图F。[0280]实施例3:细粒棘球蝴感染小鼠早期PPARs的表达水平及其对巨噬细胞极化的调节[0281]目的：本研究通过建立BALBc小鼠感染棘球蝴的动物模型，进一步验证棘球蝴感染小鼠早期小鼠腹腔巨噬细胞PPARs的表达水平，及巨噬细胞Ml型和M2型相关因子的表达水平，从而阐明包虫病感染早期PPARs的非特异性免疫调节作用。并在此基础上使用PPARs的抑制剂下调PPARs，进一步阐述其在棘球蝴逃避宿主的免疫应答中所起的作用。[0282]1材料[0283]1.1材料及试剂侗实施例2[0284]1.2主要病原体采集及小鼠来源（同实施例2[0285]2方法[0286]2.1原头蝴的采集、培养、活性鉴定同实施例1[0287]2.2小鼠感染细粒棘球蝴动物模型的建立[0288]2.2.1建立普通细粒棘球蝴感染小鼠动物模型[0289]选取6-8周的雌性BALBc小鼠，体重20±2g，随机分为实验组和对照组。感染组:腹腔接种原头蝴浓度为10000个ml，每只老鼠接种0.2ml;对照组:腹腔接种等量PBS，分别在1，5,10,15天时无菌采取外周血，颈椎脱臼法处死老鼠，提取腹腔巨噬细胞同实施例2[0290]2.2.2PPAR-aPPAR_γ阻断后细粒棘球蝴感染小鼠动物模型的建立[0291]I.PPAR-γ阻断组：用GW9662以终浓度lmgkg腹腔接种小鼠；PPAR-a阻断组：用MK-886以终浓度lmgkg腹腔接种小鼠。对照组:注射等量PBS。[0292]2.预处理24小时后，腹腔接种原头蝴方法同2.2.1。在15天时处死小鼠，取细胞。[0293]2.3ELISA检测细胞因子水平方法同实施例1[0294]2.4试剂盒法提取腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养后总RNA同实施例1[0295]2.5RNA逆转录成cDNA侗实施例1[0296]2.6实时荧光定量PCR检测（同实施例1[0297]2.7免疫印迹〇^8七6«181〇〇检测？卩厶1?-丫、？?厶1?-〇、厶找-1、1冊5、1咄及0-。衍11的蛋白表达水平（同实施例2[0298]2·7·IWesternBlot试剂配制[0299]2.7.2聚丙烯酰胺凝胶配方[0300]2.7.3聚丙烯酰胺凝胶配制[0301]2.7.5腹腔巨噬细胞总蛋白提取[0302]2.7.5WesternBlot检测[0303]2.8统计学分析侗实施例1[0304]3结果[0305]3.1细粒棘球蝴感染小鼠后不同时间点PPARs的表达水平及巨噬细胞相关因子的表达水平[0306]3.1.1细粒棘球蝴感染小鼠后PPAR-γa的mRNA表达逐渐升高[0307]图8，A和B分别为qRT-PCR检测PPAR-γa的表达水平，A图显示原头蝴感染小鼠后，PPAR-γ表达升高，15天时表达最高；B图为PPAR-a表达水平，也是逐渐升高，15天时达最高，差异有统计学意义P〈〇.05。[0308]3.1.2原头蝴与腹腔巨噬细胞共培养后PPAR-γa和IkB的蛋白表达逐渐升高[0309]如图8C、D、E，用WesternBlot方式检测PPAR-γα和IkB的蛋白表达水平，结果显示:PPAR-γ的蛋白表达水平随着感染时间增加其表达量也逐渐增加，在15天时表达最高，增加有统计学意义Ρ〈〇.05APAR-a蛋白表达水平同PPAR-γ相类似，也是15天时表达最高，IkB也是感染时间增加表达量逐渐增加，15天时达最高，增加有统计学意义（Ρ〈0.05。[0310]3.1.3原头蝴感染小鼠后Ml型巨噬细胞相关因子表达先升高后降低[0311]如图9,用qRT-PCR检测Ml型巨噬细胞相关因子TNF-a㈧、IL-Ιβ⑹和MCP-I⑹的mRNA水平，结果显示，TNF-a在小鼠感染第5天时升高最高，10天表达也增高，15天又降低；IL-Ιβ在5天时表达开始增高，10天达最高，15天时表达逐渐降低;MCP-I表达从感染第一天开始升高，一直到第10天，然后15天开始降低。用ELISA检测MCP-I⑹的表达水平，同mRNA相一致；用WesternBlot的方式检测iNOS⑴的蛋白表达水平，结果显示在感染第一天时开始增高，5天达最高，10天15天逐渐降低，差异有统计学意义（P〈0.05图9。[0312]3.1.4原头蝴感染小鼠后M2型巨噬细胞相关因子表达逐渐升高[0313]如图9,用qRT-PCR检测M2型巨噬细胞相关因子TGF-βφ,Fizz-I⑼和Arg-I⑻的mRNA水平，结果显示，TGF-β在开始共培养到5、10、15天表达均逐渐增高，15天时表达最高;Fizz-I表达水平也是逐渐增高，15天达最高;Arg-I表达趋势和TGF-β及Fizz-I相一致，15天最高。用ELISA检测Arg-I⑹的表达水平，同mRNA相一致。用WesternBlot的方式检测Arg-IJ的蛋白表达水平，结果显示其蛋白水平和mRNA水平表达相一致均为逐渐增高，15天表达最高，差异有统计学意义P〈〇.05图9。[0314]3.2加入抑制剂后PPARs的表达水平和巨噬细胞极化相关因子的表达水平[0315]3.2.1加入抑制剂后PPARγa的mRNA表达水平降低[0316]如图1〇㈧，加入GW9662PPAR-γ抑制剂后15天PPAR-γ的mRNA表达水平与未加入抑制剂组15天相比明显降低;加入MK-886PPAR-a后15天PPAR-a的mRNA表达水平与未加抑制剂组15天相比也降低明显，且差异有统计学意义P〈0.05。[0317]3.2.2加入抑制剂后PPARya及IkB的蛋白表达水平逐渐降低[0318]如图l〇B、C、D显示，加入GW9662PPAR-γ抑制剂）后15天PPAR-γ的蛋白表达水平与未加抑制剂15天相比同样降低，同时IkB的表达水平也降低;加入MK-886PPAR-a后15天PPAR-a的蛋白表达水平与为抑制时15天相比也降低，IkB的表达水平也降低，且差异有统计学意义P〈〇.〇5。[0319]3.2.3加入抑制剂后巨噬细胞Ml型相关细胞因子表达升高[0320]如图11，加入抑制剂后，原头蝴感染小鼠15天时，MCP-I、IL-Ιβ图A和TNF-a图BmRNA表达水平与未加抑制剂15天相比均升高，iNOS图E的蛋白水平也升高，升高有统计学意义P〈〇.〇5。[0321]3.2.4加入抑制剂后巨噬细胞M2型相关细胞因子表达降低[0322]如图11，加入抑制剂后，原头蝴感染小鼠15天时，TGF-f3、Arg_l图C和Fizz-I图DmRNA表达水平与未加抑制剂15天相比降低，Arg-I的蛋白水平（图F也降低，降低有统计学意义P〈〇.〇5。[0323]结论[0324]细粒棘球蝴感染小鼠早期巨噬细胞PPARs表达上调，并促进巨噬细胞极化，使其由Ml型转变为M2型，而加入PPARs抑制剂后，PPARs表达降低，巨噬细胞Ml型相关因子表达升高，M2型相关因子表达降低，表明PPARs在小鼠感染棘球蝴病早期调节巨噬细胞极化，改变其表型从而影响了巨噬细胞的功能，抑制宿主的免疫杀伤，引起了虫体的免疫逃逸。[0325]以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

权利要求：I.一种PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.体外实验1.1RAW264.7细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节用RAW264.7细胞与原头蝴共培养，在12、24、36、48、72h分别收取细胞和上清，用qRT-?〇?的方法检测??六1?-丫、？?41?-€[以及巨噬细胞組型相关因子了陬-€[、|«^-1、11^10，12型巨噬细胞相关因子Arg-1、TGF-β、FizZ-1的mRNA水平;ELISA方法检测MR和Arg-1的蛋白表达水平；1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调T；1.3小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，阻断PPARs通路，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节实验组提前用PPARya抑制剂处理腹腔巨噬细胞2小时，对照组加等量ros，然后再与原头蝴共培养，48h收取细胞，重复上述实验；步骤2.体内试验2.1建立原头蝴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节；2.2建立原头蝴感染小鼠动物模型，阻断PPARs通路检测其对巨噬细胞极化的调节在建立动物感染模型前实验组用PPARγa抑制剂处理小鼠，对照组用等量PBS处理，24h后再建模，15天时处死小鼠收集细胞，重复上述实验。2.根据权利要求1所述的PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，步骤1中，1.2小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，检测PPARs表达水平及对巨噬细胞极化的调节具体为：提取小鼠腹腔巨噬细胞与原头蝴共培养，在12、24、36、48h分别收取细胞，用qRT-PCR的方法检测PPAR-γ、PPAR-a以及巨噬细胞M1型相关因子TNF-a、MCP-1、IL-1β，M2型巨噬细胞相关因子Arg-l、TGF_0、Fizz-l的mRNA水平;WesternBlot方法检测PPAR-γ、PPAR-a、lKB、iNOS和Arg-I的蛋白表达水平。3.根据权利要求1所述的PPARs对巨噬细胞极化影响的研究方法，其特征在于，步骤2中，2.1建立原头蝴感染小鼠动物模型，检测PPARs表达水平和对巨噬细胞极化的调节，具体为：建立原头蝴感染小鼠动物模型，BALBc小鼠随机分组，实验组腹腔接种原头蝴，对照组腹腔接种等量PBS;分别于第1、5、10、15天处死小鼠，收集血清和腹腔巨噬细胞；用qRT-PCR的方法检测PPAR-γ、PPAR-a以及巨噬细胞M1型相关因子TNF-a、MCP-1、IL-1β，M2型巨噬细胞相关因子Arg-l、TGF_0、Fizz-l的mRNA水平;WesternBlot方法检测PPAR-γ、PPAR-a、lKB、iNOS和Arg-I的蛋白表达水平;ELISA方法检测MCP-I和Arg-I。

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