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申请/专利权人：天津协和华美医学诊断技术有限公司

摘要：本发明提供了两对PCR引物，该PCR引物退火温度60℃；正反向引物Tm值相差不超过2℃；目的片段长度为867bp和632bp；引物长度19‑21bp；GC含量为40‑60％，碱基呈随机分布态势；同时其特异性良好，PCR产物不形成二级结构，尤其适用于针对CEBPA基因的PCR扩增。此基础上，本发明围绕引物特征基于第一代基因测序技术开发了针对CEBPA基因的检测方法，同时实现对引物性能的验证。该方法对反应体系成分、PCR反应条件进行了全新设计，所得产物通过琼脂糖凝胶电泳验证发现目的基因具有清晰条带，切胶回收后经纯化、测序分析发现，产物确切为CEBPA基因，证明实验结果良好。

主权项：1.一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物组成。

全文数据：一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及基因检测及PCR引物设计技术，具体涉及一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法。背景技术[0002]增强结合蛋白α是维持造血系统粒系分化的重要转录因子，在调节细胞增殖与分化的平衡中起着关键的作用。此转录因子含有358个氨基酸，由基因CEBPA编码。基因CEBPA定位于19q131，全长3318bp，无内含子，cDNA全长2385bp内含多个翻译起始位点。其结构包括:N-端的转录活性区、DNA结合区、和C-端的亮氨酸丰富的二聚化功能区。正常情况下以全长42KD蛋白为主，同时存在少量30KD蛋白，二者之间比率的改变将导致其功能的改变。第一代基因测序Sanger法是检测基因CEBPA的主要方法之一。[0003]Sanger法基因测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种带有荧光标记的终止核苷酸为止，通过捕获荧光来进行分析，最后得到一系列的峰图，分析可得知其序列。[0004]由于CEBPA基因GC含量较高，PCR扩增目的片段容易产生非特异性产物，造成测序质量差，实验过程复杂;且基因序列较长，完全测通所用引物数较多，增多了实验操作次数；所需试剂成本较高。发明内容[0005]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法，以解决现有技术中利用Sanger法进行CEBPA基因检测时所需引物数量较多的技术问题。[0006]本发明要解决的另一技术问题是现有技术中由于引物性能不佳而导致CEBPA基因检测方法繁琐。[0007]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：[0008]一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物。[0009]作为优选，该PCR引物退火温度为60°C;正反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867?和632?;引物长度19-2比？;6：含量为40-60%。[0010]另一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和序列如SEQIDNO.4所示的反向引物组成。[0011]作为优选，该PCR引物退火温度为60°C;正反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867?和632?;引物长度19-2比？;6：含量为40-60%。[0012]—种应用上述PCR引物检测人类基因CEBPA的方法，该方法属于Sanger测序法，其中PCR反应成程序包括以下步骤:95°C预变性3min;95°C变性30s，52〜70°C退火30s，72°C延伸70s，32个循环;于72°C最后延伸5min。[0013]作为优选，PCR反应成程序中退火温度为60°C。[0014]作为优选，该方法中目的片段扩增反应体系每20.IyL含有以下成分=GCrackerPCRBufferIOyL，双蒸水9yL，GCrackerPCREnzyme0·IyL，10μΜ的正、反向引物各0.5yL，浓度40〜60ngyL的DNA模板0·5yL。[0015]作为优选，其中PCR反应成程序执行完毕后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，所述琼脂糖凝胶电泳实验的反应条件为：2.5%琼脂糖凝胶，加入2000bp的DNAMarker，恒压140V，电泳30min。[0016]本发明提供了两对PCR引物，该引物的设计是通过人类基因组浏览器UCSC找到CEBPA基因序列，以其为依据先利用IDTPrimerQuestTool设计两对引物，而后对其进行Blast验证，验证后进行引物合成，然后再利用通用引物M13FM13R对其5’端进行修饰后得到的。该PCR引物退火温度60°C;正反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867bp和632bp;引物长度19-21bp;GC含量为40-60%，碱基呈随机分布态势；同时其特异性良好，PCR产物不形成二级结构，尤其适用于针对CEBPA基因的PCR扩增。[0017]在此基础上，本发明围绕引物特征基于第一代基因测序技术开发了针对CEBPA基因的检测方法，同时实现对引物性能的验证。该方法对反应体系成分、PCR反应条件进行了全新设计，所得产物通过琼脂糖凝胶电泳验证发现目的基因具有清晰条带，切胶回收后经纯化、测序分析发现，产物确切为CEBPA基因，证明实验结果良好。[001S]在以上方案中，所述的“人类基因组浏览器UCSC找到CEBPA基因序列”，是指在名称为“UCSC”的网站中数据库中，从名为Feb.2009GRCh37hg19的基因组中查找的CEBPA基因序列，其网址为http:genome-asia·Ucsc·educgi-binhgGateway?redirect=manualsource=genome.ucsc.edu。[0019]在以上方案中，所述的“IDTPrimerQuestTool”是指名称为“IDT”的网站上的在线引物设计程序，其网址为http:sg·idtdna·comPrimerquestHomeIndeXo[0020]在以上方案中，所述的CEBPA基因序列是指人类基因组CEBPA的全部碱基序列。[0021]在以上方案中，所述的引物合成，是常规的引物合成方法，其具体实现方式可以在明确其序列的基础上依据本领域常规技术实施，当然也可委托普通的生物科技公司进行合成。[0022]在以上技术方案中，所述对对5’端进行修饰，是指在所设计的正、反向引物的5’端分别引入通用引物序列M13FM13R。[0023]所述通用引物M13F的序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT;所述M13R的序列为：CAGGAAACAGCTATGACCo附图说明[0024]图1是实施例1中PCR扩增产物的电泳图；[0025]图2是实施例2中PCR扩增产物的电泳图。具体实施方式[0026]以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。[0027]实施例1[0028]一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物组成。该引物对中，其正、反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867?和632?;引物长度19-2比？;6：含量为40-60%。[0029]利用以上PCR引物通过以下方法验证其PCR反应效果：[0030]目的片段扩增反应体系每20.1以1^含有以下成分:6^^1«^?〇?81^€611^1^，双蒸水9yL，GCrackerPCREnzyme0·1μί，10μΜ的正、反向引物各0.5yL，浓度60ngyL的DNA模板0.5yL。[0031]PCR反应成程序包括以下步骤:95°C预变性3min;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸70s，32个循环;于72°C最后延伸5min。[0032]PCR反应成程序执行完毕后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，所述琼脂糖凝胶电泳实验的反应条件为:2.5%琼脂糖凝胶，加入2000bp的DNAMarker，恒压140V，电泳30min。如图1所示，凝结电泳图中目的基因CEBPA具有清晰条带，证明利用该引物通过以上方法检测CEBPA基因的效果良好。[0033]实施例2[0034]一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和序列如SEQIDNO.4所示的反向引物组成。该引物对中，其正、反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867?和632?;引物长度19-2比？;6：含量为40-60%。[0035]利用以上PCR引物通过以下方法验证其PCR反应效果：[0036]目的片段扩增反应体系每20.1以1^含有以下成分:6^^1«^?〇?81^€611^1^，双蒸水9yL，GCrackerPCREnzyme0·1μί，10μΜ的正、反向引物各0.5yL，浓度40ngyL的DNA模板0.5yL。[0037]PCR反应成程序包括以下步骤:95°C预变性3min;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸70s，32个循环;于72°C最后延伸5min。[0038]PCR反应成程序执行完毕后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳实验。如图2所示，凝结电泳图中目的基因CEBPA具有清晰条带，证明利用该引物通过以上方法检测CEBPA基因的效果良好。[0039]实施例3[0040]一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物组成。[0041]利用以上PCR引物通过PCR反应检测CEBPA基因，其中PCR反应程序包括以下步骤：95°C预变性3min;95°C变性3〇8,70°：退火3〇8,72°：延伸7〇8,32个循环；于72°：最后延伸5min〇[0042]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物组成。2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于该PCR引物退火温度为60°C;正反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867bp和632bp;引物长度19-21bp;GC含量为40-60%。3.—种检测人类基因CEBPA的PCR引物，由序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和序列如SEQIDNO.4所示的反向引物组成。4.根据权利要求3所述的PCR引物，其特征在于该PCR引物退火温度为60°C;正反向引物Tm值相差不超过2°C;目的片段长度为867bp和632bp;引物长度19-21bp;GC含量为40-60%。5.—种应用权利要求1或3所述PCR引物检测人类基因CEBPA的方法，其特征在于该方法属于Sanger测序法，其中PCR反应成程序包括以下步骤:95°C预变性3min;95°C变性30s，52〜70°C退火30s，72°C延伸70s，32个循环;于72°C最后延伸5min。6.根据权利要求5所述的检测人类基因CEBPA的方法，其特征在于PCR反应成程序中退火温度为60°C。7.根据权利要求5所述的检测人类基因CEBPA的方法，其特征在于该方法中目的片段扩增反应体系每20.IyL含有以下成分:GCrackerPCRBufferIOyL，双蒸水9yL，GCrackerPCREnzyme0·1μί，10μΜ的正、反向引物各0.5yL，浓度40〜60ngyL的DNA模板0.5yL。8.根据权利要求5所述的检测人类基因CEBPA的方法，其特征在于其中PCR反应成程序执行完毕后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，所述琼脂糖凝胶电泳实验的反应条件为:2.5%琼脂糖凝胶，加入200^的0嫩1〇"1^1'，恒压140¥，电泳30111；[11。

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