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申请/专利权人:河南省农业科学院植物保护研究所
摘要:本发明涉及一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法及应用,该方法以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的核苷酸序列为模板,设计扩增SPCSV-WA cp基因的特异性引物和特异性CSV探针,提取感病甘薯叶片的总RNA;用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链,然后用CSV-CP-P2引物反转录合成cDNA第二链,利用CSV-CP-P1和反向引物CSV-CP-P2进行PCR扩增反应;以SPCSV-WA cp基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲线,通过优化反应体系和反应条件,建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法只能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.239和1,扩增效率为103.568%;最低可检测到约3.31拷贝µL的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高1000倍。本发明实时荧光定量PCR方法可用于田间甘薯样品的检测,为SPCSV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。
主权项:一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV‑WA的核苷酸序列为模板,设计扩增SPCSV‑WA cp基因的特异性引物CSV‑CP‑P1和CSV‑CP‑P2,在SPCSV‑WA cp基因内部设计特异性引物CSV‑DL1、CSV‑DL2和特异性CSV探针,设计的引物和探针序列分别为:CSV‑CP‑P1:ATGGCTGATAGCACTAAAGTCGA; CSV‑CP‑P2:TCAACAGTGAAGACCTGTTCCAG; CSV‑DL1:5′‑GACTCAGATTTGGAAACTAA‑3′; CSV‑DL2:5′‑TGGAGAATTGGAATATACTTG‑3′; CSV探针:FAM‑5′‑AACTACAGTCCGAGTATGCGTCTC‑3′‑BHQ1; (2)病毒RNA的提取和RT‑PCR用柱式总RNA抽提试剂盒,提取感病甘薯叶片的总RNA;用CSV‑DL2引物反转录合成cDNA第一链,用于实时荧光定量PCR检测;然后用CSV‑CP‑P2引物反转录合成cDNA的第二链,利用正向引物CSV‑CP‑P1和反向引物CSV‑CP‑P2进行PCR扩增反应,以得到SPCSV‑WA的标准质粒DNA; (3)实时荧光定量PCR方法的建立以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV‑WA的标准质粒DNA为模板,荧光定量PCR扩增反应体系为20 µL,包括标准质粒DNA模板2 µL,预混酶Premix Ex TaqTM10 µL,ROX Reference DyeⅡ0.4 µL,正向引物CSV‑DL1和反向引物CSV‑DL2各为0.4 µL,CSV探针0.4 µL,其中正向引物、反向引物和探针的浓度均为10µmolL,用灭菌DEPC水补足20 µL;同时设立未加模板的空白对照试验;荧光定量PCR扩增反应程序为:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s并采集荧光,共40个循环。
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